通過 SFC-UV/MS 分離西紅花主要提取物
?西紅花，又稱藏紅花，是世界上昂貴的香料之一，其花朵呈現(xiàn)一種精致的紫色色調(diào)，內(nèi)部的絲狀紅色柱頭非常珍貴。在秋天，紅色柱頭通過手工采摘并分離，生產(chǎn)一磅(0.45公斤)的西紅花柱頭需要7萬朵花。這些紅色柱頭可以用作香料、染料并且具有藥用價(jià)值。
▲ 圖1：西紅花花朵與柱頭
西紅花內(nèi)有非常多的提取物，主要成分為西紅花苷、苦番紅花素、西紅花酸等。其中許多化合物有被廣泛認(rèn)同的藥理活性， 比如西紅花苷在治療心血管疾病方面具有一定的作用。
西紅花苷存在于西紅花及梔子屬植物中，比較常見的分離法是采用高壓液相色譜法（HPLC），C-18色譜柱，流動(dòng)相為水/乙腈或水/甲醇體系。初始梯度為高含水量，有機(jī)溶劑含量隨時(shí)間而增加，以洗脫非極性化合物，分離過程中也會(huì)加入甲酸以改善峰型。[2-6]
梔子類藥材中西紅花苷類成分的定性定量分析：
▲ 圖2：A.混合對照品；B.梔子；C.水梔子的 HPLC 分離圖
西紅花苷Ⅰ 5. 西紅花苷Ⅱ 8. 西紅花苷Ⅳ 17. 西紅花苷Ⅲ
Acchrom XCharge C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）和0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫，洗脫程序?yàn)椋?～15min，22% A；15～30min，22%～25% A；30～35min，25%～28% A；35～50min，28% A；50～72min，28%～45% A；72～85min，45%～55% A；流速1mL·min-1，柱溫30℃，檢測波長440 nm，進(jìn)樣體積10μL。
本文介紹了一種利用BUCHI Sepiatec SFC-50分離西紅花柱頭主要提取物的方法。SFC-50內(nèi)置紫外檢測器并與MS（質(zhì)譜檢測器）相連，從而判斷峰物質(zhì)。
▲ 圖3：Sepiatec SFC-UV/MS系統(tǒng)
1 實(shí)驗(yàn)條件
設(shè)備 | Sepiatec SFC-50(UV/MS) |
色譜柱 | Nucleodur NH2 5μm 250 x 4 mm |
流動(dòng)相種類 | A=CO2 ;B=甲醇 |
流動(dòng)相條件 | 平衡色譜柱5分鐘 0-1 min: 14 % B 1-18 min: 14-18 % B 18-40 min: 18-50 % B 40-44 min: 50 % B |
流速 | 7 mL/min |
紫外檢測器 | 440 nm |
MASS 檢測器 | ESI (+/-) |
背壓 | 150 bar |
柱溫 | 40 ℃ |
樣品 | 1000mg 西紅花柱頭 10mL 熱甲醇提取物 |
進(jìn)樣量 | 100 uL |
2 結(jié)果與討論
▲ 圖4：西紅花提取物在紫外波長440nm下的分離圖
用甲醇對西紅花柱頭的主要成分進(jìn)行了提取后，得到的多數(shù)為極性化合物。圖4為紫外波長 440nm 下的分離圖。在前18分鐘，由于流動(dòng)相為弱極性(86- 82% CO2)，紫外檢測器下無化合物被洗脫下來。當(dāng)流動(dòng)相的極性通過梯度增加時(shí)，幾種極性化合物被依次洗脫。其中的主要提取物西紅花酸易與幾種糖(葡萄糖、龍膽二糖和三氯蔗糖)結(jié)合形成西紅花苷。因?yàn)槲骷t花酸與糖分子的共價(jià)鍵導(dǎo)致了極性的強(qiáng)烈增加，并使西紅花苷具有親水性，所以在氨基柱上的分離出峰時(shí)間比較晚[7-9]。
在質(zhì)譜檢測上，我們使用電噴霧離子源（ESI），這是一種常壓下的溫和電離方法，可以在正離子(ESI+)或負(fù)離子(ESI-)下進(jìn)行。在正離子模式下，通常會(huì)形成鈉加合物([M+Na]+)或質(zhì)子加合物([M+H]+)。在負(fù)離子模式下，([M-H]-)離子通常是由于失去一個(gè)質(zhì)子而形成的。根據(jù)樣品及其性質(zhì)的不同，也可以形成多種帶電產(chǎn)物。
▲ 圖5：(a) UV-440 nm;(b) mass 999-999.5 (ESI+);(c) mass 836.9-837.4 (ESI+);(d) mass 674.8-675.3 (ESI+);(e) mass 975.5- 976 (ESI-);(f) mass 813.4-813.9 (ESI-);(g) mass 651.4-651.9 (ESI-);(h) mass 341.2-341.7 (ESI-)
▲ 圖6：西紅花苷Ⅰ(a) ESI+ and (b) ESI-, 西紅花苷Ⅱ(c) ESI+ and (d) ESI-, 西紅花苷Ⅲ (e) ESI+ and (f) ESI- 以及西紅花酸單甲酯(g)ESI-的質(zhì)譜圖
圖5與圖6展示了西紅花甲醇提取物通過 Sepiatec SFC-50 結(jié)合 MS 檢測器后的分離圖譜，信號(hào)基于不同的 m/z（質(zhì)子數(shù)/電荷數(shù)）。根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果我們可以推斷出表1的結(jié)構(gòu)式結(jié)果。
No. | 化合物名稱 | 結(jié)構(gòu)式 | m/z |
1 | 西紅花苷Ⅰ |  | 976.4 C44H64O24 |
2 | 西紅花苷Ⅱ | 814.8 C38H54O19 | |
3 | 西紅花苷Ⅲ |  | 652.7 C32H44O14 |
4 | 西紅花酸單甲酯 | 342.4 C21H26O4 |
▲表1：根據(jù)圖5推斷的西紅花主要提取物的結(jié)構(gòu)式和摩爾m/z
西紅花苷Ⅰ是由西紅花酸和兩個(gè)龍膽二糖分子組成。在圖5中，該化合物 ESI+ 模式下的檢測 m/z 為 999-999.5，其加合物由鈉(m/z 23 g/mol)和樣品分子(m/z 976.4 g/mol)組成。在 ESI- 模式下也可以檢測到西紅花苷Ⅰm/z 為975.5-976。其對應(yīng)的圖6質(zhì)譜圖為(a)與(b)。
西紅花苷Ⅱ由西紅花酸、葡萄糖和龍膽二糖分子組成。在 ESI+ 模式(圖5(c))和 ESI- 模式(圖5(f))下，分別為(m/z 836.9-837.4[M+Na]+)和(m/z 813.4-813.9[M- H]-)。其對應(yīng)的圖6質(zhì)譜圖為(c)與(d)。
西紅花苷Ⅲ在 ESI+ 模式(圖5(d))和 ESI- 模式(圖5(g))下，分別為(m/z 674.8-675.3[M+Na]+)和(m/z 651.4-651.9[M-H]-)。其對應(yīng)的圖6質(zhì)譜圖為(e)與(f)。
西紅花酸單甲酯只能在 ESI- 模式(圖5(h))下鑒別，m/z為341.2-341.7[M-H]-。其對應(yīng)的圖6質(zhì)譜圖為(g)。
在 ESI 過程中，樣品分子會(huì)被碎片化，特別是在 ESI- 模式中。例如，西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ上的葡萄糖基團(tuán)在ESI-模式下的脫離，導(dǎo)致其在圖5(g) m/z 651.4-651.9[M-H]- 中也被鑒定出來。
3 結(jié)論
Sepiatec SFC-50 可以有效分離西紅花柱頭內(nèi)結(jié)構(gòu)相似的提取物，為了鑒別里面的未知成分，采用 SFC-UV/MS 結(jié)合的形式，適用于多數(shù)天然產(chǎn)物應(yīng)用。相比 HPLC 的流動(dòng)相，超臨界二氧化碳具有高擴(kuò)散系數(shù)和低粘度的特點(diǎn)，并且得益于二氧化碳的弱酸性，無需加入甲酸也能獲得不錯(cuò)的峰型。在選擇性上，由于 SFC 屬于正相色譜，在出峰順序和時(shí)間上與傳統(tǒng)的 RP-LC 不同，這使得 SFC 在分離一些化合物組分時(shí)具備出峰時(shí)間上的優(yōu)勢。比如本次分離中的西紅花苷Ⅲ，在圖2的 RP-LC 中，出峰順序靠后，時(shí)間在 60 分鐘之后；而在圖5的 SFC 中，其出峰順序靠前，時(shí)間在 28-29 分鐘。這在分離一些極性偏弱的化合物時(shí)可以節(jié)省很多時(shí)間。
4 參考
DOI: 10.13140/RG.2.2.19634.40649
dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2015.06.090
DOI: 10.1081/FRI-100100281
DOI: 10.1016/j.foodchem.2005.11.020
doi.org/10.1016/j.jpba.2020.113094
葉瀟，張東，馮偉紅，梁曜華，劉曉謙，李春，王智民．梔子類藥材中西紅花苷類成分的定性定量分析[J/OL]．中國中藥雜志.
doi.org/10.19540/j.cnki.cjcmm.20220214.301
doi.org/10.1021/acs.jafc.5b03194
doi.org/10.1073/pnas.140462911
DOI: 10.1007/s00425-004-1299-1
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