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膜蛋白研究利器（1）
膜蛋白研究利器：
Rho1D4親和純化體系+Nanodiscs(納米磷脂盤)
在人體蛋白中有大約
30%是膜蛋白，膜蛋白在細胞進行物質、信息、能量交換中發揮著重要作用，膜蛋白也成為大多數重要的藥物研究對象和靶點。ＦＤＡ批準的新藥中就有大多數都以膜蛋白為靶點，幾乎所有的膜蛋白都是研究熱點。然而讓人吃驚的是，樂觀估計，目前已經被透徹研究清楚結構的膜蛋白僅占膜蛋白總量的1%。究其原因，是因為膜蛋白依附或橫跨在細胞膜的磷脂雙分子層上，使膜蛋白的表達、純化、結晶和結構分析都有很大難度。市面上有一些專用于膜蛋白提取的試劑盒，大多數只能提取某幾種類型的膜蛋白，有些試劑盒用于提取膜總蛋白（包括質膜和細胞器膜蛋白）。
現在，德國
Cube Biotech公司推出了一種新型膜蛋白提取工具能夠特異性親和純化重組膜蛋白，同時具有高純度、高特異性、高載量、溫和提取的特點，可以更好地幫助科研人員想深入研究膜蛋白，進而攻克困擾人類的各種疾病。這種技術是基于1980年科學家在牛眼視網膜中發現的一種命名為Rho1D4的氨基酸序列以及其對應的抗體來作為親和標簽純化膜蛋白取得了非常好的效果，將Rho1D4抗體鏈接在瓊脂糖或磁珠上，用于親和層析帶有Rho1D4標簽的膜蛋白。
Rho1D4特異性親和純化重組膜蛋白產品系列（瓊脂糖/磁珠）
當膜蛋白被成功提取出后需要對其結構及功能的研究。由于膜蛋白存在疏水部分，因此在體外容易聚合，所以需要找到一種合適的方法讓膜蛋白能夠穩定地存在于細胞外的環境。傳統的膜蛋白提取后都保存在去污劑中，但自然條件下作為“鑲嵌"在細胞膜磷脂雙分子層中的蛋白一旦脫離了其穩定的天然膜環境，便會對其生理功能的發揮產生不同程度的影響甚至受到*的破壞。Cube Biotech公司的Nanodiscs試劑盒可以解決分離出的膜蛋白在體外環境中穩定存在的問題，確保膜蛋白能夠像在天然的細胞膜中維持其構象和生物學功能，使其在有利的條件下用于后續的功能研究。
Cube Biotech Nanodiscs試劑盒系列產品
早在上個世紀
90年代，來自University of Illinois的生化學家Stephen Sligar教授就提出了命名為“Nanodisc"的磷脂層結構。Nanodiscs這種膜蛋白提取工具打破了原有提取方法的瓶頸，能夠高效而溫和地輔助于膜蛋白的提取和保持其構象，這種膜蛋白提取輔助工具可以解決傳統提取方法容易出現的問題。
目前，
Rho1D4純化體系和Nanodiscs在膜蛋白提取和研究方面已經應被許多著名的科研院校、制藥企業所采用和青睞。無論是兩種技術的配合使用或是單獨使用都很好地推動了膜蛋白相關領域的研究進展。本文將對這兩種技術有更詳細的解讀與應用說明。
Rho1D4體系和Nanodiscs的技術解讀與應用說明
一、 Rho1D4體系：反應條件溫和的高特異性親和純化方法
1) 什么是Rho1D4?
Rho1D4是指在牛眼視網膜細胞內的牛視紫紅質C端的最后九位氨基酸。Rho1D4得名于與該序列特異性結合的單克隆抗體1。與Rho1D4抗體結合的表位可以作為針對膜蛋白的超高特異性純化標記。
通過基因修飾可在欲研究的目標（膜）蛋白
C端加上Rho1D4標記（如圖1）。一旦加載上該序列，即可用裝載有Rho1D4抗體的親和基質去捕獲目標蛋白，隨后添加Rho1D4肽，通過競爭性結合基質抗體的方式來洗脫目標蛋白。采用這種方法，相比改變pH值等其他洗脫方式，更加地溫和。
圖1：假設有3個跨膜域的膜蛋白。Rho1D4標簽加到膜蛋白C端，它的序列是T-E-T-S-Q-V-A-P-A
2) Rho1D4的歷史
Rho1D4的表位和抗體配對最早于20世紀80年代被發現，當時科學家將Rho1D4抗體交聯包被在瓊脂糖凝膠上，用來純化通過猴腎細胞表達的牛視紫紅質。1,2從那時起，Rho1D4系統開始被廣泛的用于小量膜蛋白提取的研究中，包括GPCR（G蛋白偶聯受體），ATP結合盒轉運蛋白（ATP-binding cassette transporter），溶質反向轉運體和以及一種含四個跨膜域的膜蛋白。
3) Rho1D4系統的優勢和用途
l 高特異性且高純度
Rho1D4系統包含：標簽、抗體偶聯親和基質（瓊脂糖或磁珠等）以及洗脫多肽。Rho1D4系統的優勢在于抗體與抗原相互作用的高度特異性。表位序列和鏈長對結合至關重要，例如：將第三位丙氨酸替換成甘氨酸，即移去一個甲基基團，抗體將不再與表位結合。同樣，完整的九個氨基酸標簽會與Rho1D4抗體結合緊密，去除兩個氨基酸則阻斷結合。因此，含有與Rho1D4表位相似序列的蛋白引起的非特異性結合被最小化，因此回收蛋白的純度非常高。（見表1） 3,4,5,6,7,8
l 高回收量
而Rho1D4系統的另一個優勢是洗脫目標蛋白的高回收率。包括細菌，酵母和哺乳動物細胞系在內的表達系統已經針對特定的GPCR和其他膜蛋白進行了優化。用Rho1D4系統純化后的膜蛋白通過凝膠過濾以除去用于洗脫的多肽。使用此純化系統的科研人員均反饋蛋白回收量均達到毫克級。（見表1）3,4,5,6,7,8
l 純化的膜蛋白可用于功能性研究
純化的蛋白可用于功能性研究（配體結合的特性、蛋白與蛋白間的相互作用等）。
例1：
將標記過的
ABCA4固定在載有Rho1D4抗體的基質上來確定它與天然配體（一種視網膜的加成物）的親和結合特性，加入ATP后即釋放2。
例2：
CD81蛋白被整體固定在涂有Rho1D4抗體的平板上，它表現出和分離可溶蛋白片段與丙型肝炎病毒包膜E2蛋白相同的親和結合力3。
另外，有陰離子轉運載體
AE1結構域的重組蛋白被標記且用Rho1D4系統純化后表現出與紅細胞來源的AE1蛋白有相同的硫酸外排速率。
4) 利用Rho1D4純化膜蛋白圖解簡述
圖2：Rho1D4純化膜蛋白示意圖
表1：膜蛋白應用實例
*純度是從低濃度經一步Rho1D4 IAC在反應溶液中得出的；產率是在洗脫成分濃縮并過SEC柱后計算的。
表1：有文獻報道的使用Rho1D4系統純化膜蛋白的純度和產率。盡管很多用Rho1D4系統純化的膜蛋白均為G蛋白偶聯受體家族，該系統也可以有助于辨別其他如轉運體之類的膜蛋白。相關文章在參考文獻中。IAC：免疫親和層析；SEC：排阻層析。
二、Nanodiscs：還原細胞膜環境的人造磷脂雙分子層
1）什么是Nanodiscs
Nanodiscs是由膜支架蛋白(membrane scaffold proteins, MSPs)和磷脂分子構成的磷脂雙分子層類膜結構。通過這種特殊的結構，膜蛋白可以整合到Nanodiscs中，保持膜蛋白生物學活性，為膜蛋白研究提供了充分的技術支持，科研人員便可以在有利的條件下繼續開展后續的功能研究。
膜支架蛋白(MSPs)是載脂蛋白(apo) A-I的縮減版，它們包繞著脂質雙分子層從而形成圓盤狀的結構，即納米盤3。其包含一個朝向內部脂層的疏水面和朝外的親水面。這一結構使得Nanodiscs在水溶液中具有很高的溶解度，同時在沒有去污劑的情況下也可以使膜蛋白溶解。
圖3：膜蛋白組裝到Nanodiscs的原理圖。綠色：膜支架蛋白（MSPs）；灰色：磷脂；橙色：膜蛋白
根據所使用的
MSPs的不同，形成的Nanodiscs的直徑會有所差異，這些納米級雙層微粒的直徑約為7-13納米。應用廣泛的MSPs包括MSP1D1、MSP1D1-dH5和MSP1E3D1，具體尺寸見表2。
表2 ：不同類型的MSPs的尺寸
2）為什么選擇Nanodiscs
在膜蛋白研究方面，尤其是配體結合研究、構象動力學分析以及蛋白相互作用的研究，
Nanodiscs體系與其他體系相比有諸多優勢4。Nanodiscs可以使膜蛋白，如GPCRs或轉運蛋白等，在人造環境里和納米盤重新組裝起來，形成類似天然的細胞膜結構。這種組裝到Nanodiscs中的可溶性蛋白可以在沒有去污劑的情況下用常規的層析方法來進行純化。Nanodisc與膜蛋白的組裝結構使得膜蛋白能夠在體外研究膜蛋白在生理上細胞內和細胞外的兩面，因此也使得進一步研究拮抗劑、激動劑、G蛋白以及其它相互作用的配體不再受限。
3）Nanodiscs優勢：
l Nanodiscs 能夠為提取出來的膜蛋白提供一個穩定環境使它們繼續工作，就好像還沒有離開原來細胞膜一樣。 細胞膜蛋白之所以研究難度大是在于膜蛋白從細胞膜上提取出來以后就無法行使其正常功能，使得研究這些受體分子相當困難。為了解決這個難題，Stephen Sligar 等科學家研發出一種脂質納米圓盤 (lipid-based Nanodiscs)可以替代細胞膜上磷脂雙層膜 (phospholipid bilayer)，讓被純化出來的細胞膜蛋白如同一般細胞膜蛋白一樣穩定地行使其正常功能。
l Nanodiscs 和天然細胞膜的組成結構一樣，是由兩層磷脂層組成，每個磷脂分子都有活躍并親水的頭部基團和疏水尾部。Nanodiscs 的結構就像一般細胞膜一樣，由兩層背對背的磷脂 (phospholipid)所組成，為了使納米圓盤表面能保持這個扁平的形狀，研發人員為這個Nanodiscs 外面加上一圈蛋白質(MSPs)。
l Nanodiscs 應用前景非常廣泛，這個技術將有助于解開一大堆未知的膜蛋白的生化行為模式，也將幫助得到膜蛋白的結晶，從而應用X 射線晶體衍射學獲得在原子水平上的結構圖。
4）將膜蛋白組裝到Nanodiscs中的兩種方法：
方法1：組裝溶解在去污劑中的膜蛋白
在適合去污劑存在下，將膜蛋白溶解并純化，然后再添加
MSPs和磷脂。含有膜蛋白的Nanodiscs能夠自發地組裝，在去除掉表面活性劑后可以通過凝膠過濾（排阻層析）等方式來純化。
方法2：Nanodiscs與無細胞表達體系相結合
另一個方法是，膜蛋白在無細胞表達體系中被表達，通過加入已經和膜蛋白結合預先組裝的Nanodiscs，膜蛋白能通過無細胞表達系統表達出來。采用這種方法，就無需再添加去污劑，在極大程度上降低了人為添加試劑對最終結果的影響。雖然通過無細胞表達體系會將蛋白的產量限制在微克級別，但這種方式卻為蛋白修飾、生物素酰化或同位素標記等研究手段提供了更多發展方向的可能性。
圖4：膜蛋白與Nanodisc的兩種組裝機制
左圖：膜蛋白（橙色）溶解在去污劑（深灰色）中并與凍干的MSP（綠色）和磷脂（淺灰）混合。然后去除去污劑，形成蛋白-Nanodisc復合物。
右圖：預組裝了MSP與磷脂的Nanodiscs加入到無細胞反應液（cell-free expression systems）中，新生的膜蛋白能夠自發地組裝到Nanodiscs中。
5）Nanodiscs的應用
Nanodiscs為膜蛋白在體外提供了非常穩定的環境，并可以在這個環境下研究配體的結合，或用NMR和SPR研究拮抗劑與激動劑。MSPs可以與組氨酸標簽結合來促進純化、檢測和固定化。
Nanodiscs其它方面的應用還包括共振拉曼（resonance Raman）、低溫電子顯微學（Cryo-EM）、MALDI 、蛋白活性研究和時間分辨熒光光譜。將抗原組裝到Nanodiscs中已經被用來提高小鼠的免疫反應，說明其具備用于制備疫苗和生產抗體的極大潛能。
最近，大腸桿菌全細胞膜蛋白組被組裝到了
Nanodiscs中，為以后的研究構建了一個可溶解的膜蛋白信息庫。更多Nanodiscs的應用請參見表3。
表3 :Nanodiscs應用舉例
圖5：納米磷脂盤包裹膜蛋白研究實例（來源：Sligar Lab）
在過去幾年里，業內已經發表了多篇關于Nanodiscs的應用文獻，例如：Nanodisc系列產品MSP1D1-His和MSP1D1dH5-His的應用已刊登在《美國化學會-應用材料與界面》（ACS Applied Materials & Interfaces），Cube Biotech科學家 Dr. Barbara Maertens、法蘭克福大學生物物理化學研究所 Dr. Frank Bernhard和Dr. Erik Henrich在Springer旗下的BIOspektrum期刊聯合發表文章并提出Cube Biotech的Nanodisc試劑盒是有效用于研究膜蛋白結構/功能的新工具。目前，許多研究人員正在利用Nanodiscs研究出更多與之相關的技術與應用。
圖6：有關Nanodiscs的文獻發表情況。從2003—2013年，利用Nanodiscs進行膜蛋白研究的相關報道在不斷增加。（來源：PubMed）
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