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冷凍電鏡結合Nanodisc在膜蛋白研究的應用
細胞生物膜所含的蛋白稱為膜蛋白，其參與和行使了眾多細胞功能，包括細胞與外界進行物質運輸、信息傳遞、能量交換等。膜蛋白擔任了各種神經信號分子、激素和其他底物的受體，構成了各種離子跨膜的通道，以及構成各類轉運蛋白。在人體蛋白中，有大約 30% 是膜蛋白。FDA 批準的新藥中，大多數都以膜蛋白為靶點。
隨著對膜蛋白工作機理的深入研究，新的細胞調控作用靶點不斷被發現，從而使作用于靶點的新藥能更有針對性地被開發出。例如現在市面上有不少基于細胞轉運通道蛋白設計的藥物，常見的一類抗高血壓藥（如氨氯地平），其主要功能是鈣離子通道阻滯劑，選擇性的同離子通道結合以阻滯鈣離子進入細胞，從而導致心肌收縮力減弱、心率減慢和血管擴張等以達到降壓的作用。膜蛋白結構是設計并開發靶向作用于膜蛋白藥物的重要依據，但目前已被研究清楚結構的膜蛋白僅占膜蛋白總量的 1%。這是因為膜蛋白依附或橫跨在細胞膜的磷脂雙分子層上，所以膜蛋白的純化、結構的解析等都特別具有挑戰性。
對蛋白包括膜蛋白結構的解析和研究是蛋白研究的基礎， X 射線晶體學、核磁共振（NMR）和冷凍電鏡（Cryo-EM）被稱作結構生物學研究的三大利器，在現今已解析的膜蛋白結構中，90% 以上都采用的是 X 射線晶體學方法，而核磁共振在小分子量的蛋白結構解析中發揮了重要的作用。數十年里，X-射線晶體學一直是解析蛋白質結構的優選方法。然而 X 射線晶體學方法對樣品要求很高，需要得到具有衍射能力的蛋白晶體。但許多的蛋白質，尤其是膜蛋白和蛋白質復合物卻難以結晶。而另一方面，NMR 可用來解析較小的蛋白的結構（一般不超過 30 kDa），但較難用于分子量較大蛋白的結構解析。在之前的很長時間里，冷凍電鏡由于其解析結構的分辨率較低，一直未能得到廣泛的應用。近年來，冷凍電鏡領域里硬件和算法的突破性進展使得現在能夠利用 cryo-EM 解析近原子分辨率的結構，及大地促進了結構生物學的發展。
不同于晶體學，cryo-EM 所需的樣品量很少、無需生成晶體而只需保持水溶液環境下穩定。在 2013 年末，美國加州大學舊金山分校的Yifan Cheng教授與同事 David Julius 合作，利用單電子計數探測器，以近原子分辨率 (3.4 ?)，確定了在疼痛和熱知覺中起中心作用的一種膜蛋白 TRPV1 的結構。這一研究成果讓相關領域工作者開始重新審視冷凍電鏡在結構生物學研究中的所能發揮的作用。這對于一些難結晶的蛋白質，特別是膜蛋白的結構生物學研究提供新的契機。隨著不斷的嘗試，利用冷凍電鏡對膜蛋白結構解析的成果也越來越多，作為藥物研發方面的應用，要分析小分子與蛋白質的互作，而且分辨率越高越好。現在 Subramaniam 等人達到了 cryo-EM 成像迄今為止的高分辨率（2.2 ?），此前只有 X 射線晶體衍射達到過這種水平的分辨率，這能為人們提供足夠的結構信息，進行更好的藥物研發。
圖 1：分辨率對觀測結果的影響（左）不同分辨率對應能測定的分子結構（右）（圖片來源：Elad Binshtein, Melanie D. Biochemistry, 2015）
膜蛋白基本可分為三大類：整合膜蛋白、外周膜蛋白和脂錨定蛋白。整合膜蛋白占膜蛋白種類的 70%～80%。外周膜蛋白一般為水溶性，相對容易分離和純化，也較易獲得結晶供 X 射線衍射分析。難于研究的是整合膜蛋白，由于其具有疏水的跨膜區域，因此直接暴露在水溶液環境下非常不穩定，因此需要添加去污劑進行穩定。而當用去污劑保護膜蛋白進行結構解析和功能研究時，又會因為膜蛋白離開其天然磷脂雙分子而丟失有關脂質互作及它們對蛋白結構影響這一層重要信息。這尤其對需要脂質起結構和調節作用的蛋白質有較大影響。另外，不合適的去污劑會使膜蛋白不穩定，且去污劑膠束與磷脂分子的結構差異及水脂界面彎曲度在某些情況下可能造成膜蛋白結構的改變。
為了更好地讓膜蛋白能夠穩定在水溶液環境下通過冷凍電鏡進行結構解析，且避免去污劑會帶來的潛在影響，作為模擬細胞膜磷脂雙分子層結構的 Nanodisc 是確保實驗結果不受各種不確定因素影響的解決方案。Nanodisc 起初由 UIUC 的 Stephen Sligar 教授提出，其由膜支架蛋白 (membrane scaffold proteins, MSPs) 和磷脂分子構成的磷脂雙分子層類膜結構。Nanodisc 的理化性質與細胞膜磷脂雙分子層相似，且膜蛋白可以整合到 Nanodisc 中，極大范圍地保持其結構穩定和生物學活性，為膜蛋白的研究提供了有力的技術支持。膜支架蛋白（MSPs） 是載脂蛋白（apo）A-I 的縮減版，它們包繞著脂質雙分子層從而形成圓盤狀的結構，即 Nanodisc。其包含一個朝向內部脂層的疏水面和朝外的親水面。這一結構使得 Nanodisc 在水溶液中具有很高的溶解度，同時具有非常高的穩定性。通過 Nanodisc 包裹，純化后的膜蛋白在保持空間結構穩定和活性的同時，也將模擬膜蛋白原有在細胞膜上的狀態，跨膜域被包埋在磷脂雙分子層內部。
圖2：膜蛋白組裝到Nanodiscs的原理圖。綠色：膜支架蛋白（MSPs）；灰色：磷脂；橙色：膜蛋白(圖片來源Cube Biotech網站)
將膜蛋白組裝到Nanodiscs中主要有兩種方法：
第一：組裝溶解在去污劑中的膜蛋白在去污劑存在條件下將膜蛋白純化，然后再添加MSPs和磷脂。含有膜蛋白的Nanodiscs能夠自發地組裝，在去除掉表面活性劑后可以通過凝膠過濾（排阻層析）等方式來純化。
第二：Nanodiscs與無細胞表達體系相結合，針對于一些特殊蛋白，例如帶有毒性的蛋白可通過無細胞表達體系表達，通過加入已經預先組裝的Nanodiscs使表達出的膜蛋白通過自組裝鑲嵌進去。
圖3：膜蛋白與Nanodisc的兩種組裝機制(圖片來源Cube Biotech網站)
左圖：膜蛋白（橙色）溶解在去污劑（深灰色）中并與凍干的MSP（綠色）和磷脂（淺灰）混合。然后去除去污劑，形成蛋白-Nanodisc復合物。
右圖：預組裝了MSP與磷脂的Nanodisc加入到無細胞反應液（cell-free expression systems）中，新生的膜蛋白能夠自發地組裝到Nanodisc中。
結合Nanodisc和冷凍電鏡這兩項技術，越來越多的膜蛋白結構得以解析。其中較有代表性的包括Yifan Cheng教授通過闡明Nanodisc中TRPA1的結構解釋了配體和脂質的作用機制，確定了環狀脂質和調節脂質的定位，證實通過形成一種三元復合物，特異的磷脂互作促進了一種蜘蛛毒素等相關配體結合TRPV1，相關成果發表在2016年Nature上。此外由于Nanodisc還可以實現在同一個Nanodisc上實現寡聚、二聚和單體的鑲嵌，來自歐洲的Rouslan G及其合作者在Nanodisc上鑲嵌ryanodine受體四聚體使用冷凍電鏡實現了結構解析，相關成果也發表在2015年Nature雜志上。相信伴隨著冷凍電鏡解析能力的不斷提升，以及如Nanodisc穩定膜蛋白和還原膜蛋白天然環境技術的不斷出現，膜蛋白結構解析和功能研究將會迎來全新的發展。
圖4：通過冷凍電鏡解析Nanodisc包裹TRPA1蛋白結構，b、c灰色部分為Nanodisc（圖片來源于Yifan Cheng2016 Nature 文章）
圖5：通過冷凍電鏡解析Nanodis 包裹ryanodine受體四聚體結構，灰色部分為Nanodisc（圖片來源于RouslanG 2015 Nature 文章）
參考文獻：
1. Yifan Cheng , et al. A Primerto Single-ParticleCryo-Electron Microscopy. 161(3):438 (2015).
2. Elad Binshtein, Melanie D. OhiCryo-Electron Microscopy and theAmazing Race to Atomic Resolution [J].Biochemistry, 54: 3133-3141 （2015）.
3. Yifan Cheng , et al. Single-particleelectron cryomicroscopy. Nature Methods 11, 30 (2014).
4. Li, X. et al. Electron countingand beam-induced motion correction enablenear-atomic-resolution single-particlecryo-EM. Nature Methods 10, 584–590(2013)
5. Bayburt, T.H., Grinkova, Y.V.& Sligar, S.G. Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticleswith membrane scaffold proteins. Nano Lett. 2, 853–856 (2002).
6. Bartesaghi A, Merk A, BanerjeeS, Matthies D, Wu X, Milne JL, Subramaniam S. Electron microscopy. 2.2 ?resolution cryo-EM structure of β-galactosidase in complex with a cell-permeantinhibitor. Science. 5;348(6239):1147-51 (2015).
7. Sun L, Zhang X, Gao S, Rao PA,Padilla-Sanchez V, Chen Z, Sun S, Xiang Y, Subramaniam S, Rao VB, Rossmann MG.Cryo-EM structure of the bacteriophage T4 portal protein assembly atnear-atomic resolution. Nat Commun. 6;6:7548 (2015).
8. Ilia G Denisov，Sligar, S.G. Nanodiscsfor structural and functional studies of membrane proteins. Nature Structural &Molecular Biology23,481–486(2016)
9. Rouslan G. E, et al. Architecture and conformationalswitchmechanism of the ryanodine receptor. Nature 517. 39 (2015).
10. Lagers tr?m, M.C. et al.Structural diversity of Gprotein-coupled receptors and significance for drugdiscovery. Nature Reviews Drug Discovery 7, 339-357 (2008).
11. Hagn, F. et al. Optimizedphospholipid bilayer Nanodiscs facilitate high-resolution structuredetermination of membrane proteins. J.Am.Chem. Soc., 135:1919-1925(2013).
12. Wang, Z. et al. Tyrosinephosphorylation of Mig6 reduces its inhibition of the epidermal growth factorreceptor. ACS Chem. Biol. 8(11):2372-6, (2013).
13. Timothy H. B, et al. TransducinActivation by Nanoscale Lipid Bilayers ContainingOne and Two Rhodopsins. JOURNALOF BIOLOGICAL CHEMISTRY. 282 (2007).
14. Krueger-K, et al. An evaluationof detergents for NMR structural studies of membrane Proteion. J Biomol NMR,28(1) 43-57 (2004).
15. Yoshiura C, et al. NMR analysesof the interaction between CCR5 and its ligand using functionalreconstitutionof CCR5 in lipid bilayers. J Am Chem Soc, 132 (19): 6 768-6 777 (2010).
16. Erik Henrich, et al. Analyzingnative membrane proteinassembly in nanodiscs by combined noncovalent massspectrometry and syntheticbiology. eLife6:e20954 (2017).
17. Moers et al., Modified lipidand protein dynamics in Nanodiscs. Biochim. Biophys. Acta, 1828(4):1222-9, (2013).
18. Nasr. et al., Radioligandbinding to Nanodisc-reconstituted membrane transporters assessed by thescintillation proximity assay. Biochemistry, 14;53(1):4-6, (2014).
19. 畢允晨，王玉娟，王俊峰.Nanodisc體系在膜蛋白結構與功能研究中的應用。 《波譜學雜志》, 28(2):177-189（2011）
20. 張凱.什么是2015年受科學界關注的新技術？知乎專欄，(2016)
21. Yifan Cheng博士Nature發表突破性成果.生物通.(2016)
22. Nature Methods公布2015年度技術-生物通,(2016)
