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【感受態(tài)細(xì)胞的制備】 用CaCl2處理制備新鮮的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞
1.從37℃培養(yǎng)16~20h的新鮮平板中挑取一個(gè)單菌落（如大腸桿菌DH52），或1ml新鮮的16~20h過(guò)夜培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)到一個(gè)含有100mlLB培養(yǎng)基的1L或500ml培養(yǎng)瓶中。于37℃振搖培養(yǎng)約2~3h（旋轉(zhuǎn)搖床200~300r/min），每隔20~30min測(cè)量OD600值≈0.4。2.在無(wú)菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)，用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯離心管中，冰上放置10~20min。3.于4℃4000轉(zhuǎn)/分離心10min，回收細(xì)菌細(xì)胞。4.將管倒置1min，以使zui后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。5.以10 -
【感受態(tài)細(xì)胞的制備】 電擊和熱擊感受態(tài)細(xì)胞的制備
實(shí)驗(yàn)試劑LB培養(yǎng)基，KB培養(yǎng)基，10%甘油，液氮，0.1MCaC12溶液實(shí)驗(yàn)設(shè)備超凈工作臺(tái)，搖床，離心機(jī)，250mL離心瓶，0.5mL的離心管實(shí)驗(yàn)材料大腸桿菌，農(nóng)桿菌和假單胞桿菌實(shí)驗(yàn)步驟1.電擊感受態(tài)細(xì)胞的制備1）-80℃保存的大腸桿菌，農(nóng)桿菌或者假單胞桿菌在固體平板上（DH，BL21在LB平板上，GV3101在LB/Gen;P.s.pv.tomato0288-9和P.syringaepv.tabaci6505在KB平板上）劃線。2）接種單克隆于5-10mL液體培養(yǎng)基，37℃（大腸桿菌）或者28 -
細(xì)胞表面分子流式檢測(cè)步驟說(shuō)明注意事項(xiàng)1．在使用抗體之前，快速甩動(dòng)一下，使之聚集到管的底部；2．熒光標(biāo)記的抗體應(yīng)該避光保存在4℃，不要冷凍；3．當(dāng)染色的時(shí)候，固定或延遲分析可能降低某些抗體的熒光信號(hào)。為了得到更好的結(jié)果，染色后應(yīng)該馬上分析。過(guò)程概述：1．制作外周血、淋巴組織或者培養(yǎng)細(xì)胞的單細(xì)胞懸液；2．細(xì)胞染色抗體（包括直接標(biāo)記抗體和間接標(biāo)記抗體）；3．洗滌步驟棄掉所有的為束縛的試劑4．運(yùn)行分析流式儀。注意：流式細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)中，所有實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化都很重要。關(guān)鍵參數(shù)包括靶細(xì)胞、抗體效價(jià)以及動(dòng)力學(xué)。試
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方案A：兩步法胞內(nèi)（細(xì)胞質(zhì)）蛋白染色。方案B：一步法胞內(nèi)蛋白染色（細(xì)胞核）。注意：1、不同細(xì)胞因子的刺激條件是不同的，比如：LPS刺激活化單核細(xì)胞分泌IL-6的培養(yǎng)時(shí)間一般是6個(gè)小時(shí)，而檢測(cè)IL-10則需要刺激24小時(shí)。2、結(jié)合熒光的流式抗體應(yīng)在4度，避光儲(chǔ)存。3、使用抗體前請(qǐng)低速離心30秒，使貼壁抗體沉底。不建議斡旋混勻抗體，可用手指輕彈混勻。4、除非方案中注明，默認(rèn)的抗體孵育方法是冰上或4度避光。5、緩沖液中加BSA或FBS可以減少固定破膜后的非特異性背景。方案A:兩步法胞內(nèi)（細(xì)胞質(zhì)）蛋白染
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方案A：細(xì)胞懸液的表面抗原染色。方案B：一步法胞內(nèi)蛋白染色（細(xì)胞核）。小貼士：1、流式抗體要儲(chǔ)存于避光4度，嚴(yán)格避免凍融。2、流式抗體使用前要離心3min，避免貼壁蓋的損失，請(qǐng)勿斡旋混勻。3、避免細(xì)胞成團(tuán)，以免堵塞流式細(xì)胞儀。4、eFluor納米晶體抗體參照該品說(shuō)明進(jìn)行改善。方案A:細(xì)胞懸液的表面抗原染色實(shí)驗(yàn)材料：15×75mm圓底流式管或96孔板直標(biāo)一抗或純化抗體二抗（可選）抗小鼠CD32/16抗體（eBioscienceCat.No.14-0161）人FC?R結(jié)合抑制劑（eBioscienc
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方案A：組織培養(yǎng)細(xì)胞的制備。方案B：淋巴組織細(xì)胞制備。方案C：非淋巴組織細(xì)胞制備。方案D：全血PBMC的分離。小貼士1、流式細(xì)胞儀檢測(cè)需要將細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液。2、避免細(xì)胞成團(tuán)，以免堵塞流式細(xì)胞儀。3、實(shí)體組織制備單細(xì)胞懸液需要物理方法分離或酶消化法進(jìn)行，具體組織的方法，依照經(jīng)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行。方案A:組織培養(yǎng)細(xì)胞的制備實(shí)驗(yàn)材料：Accutase™酶細(xì)胞分離培養(yǎng)基（eBioscienceCat.No.00-4555）eBioscience®流式染色緩沖液（eBioscienceCat.No.00-42
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以CaspGLOW™FluoresceinActiveCaspase-3StainingKit（88-7004）為例。1.根據(jù)文獻(xiàn)中方法誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡，準(zhǔn)備未誘導(dǎo)細(xì)胞作為陰性對(duì)照，另外一種陰性對(duì)照用1ulZ-VAD-FMK抑制劑制備。2.將細(xì)胞加入300ul*培養(yǎng)基中，濃度為1×106.3.加1ulFITC-DEVD-FMK在5%CO237攝氏度下孵育30~60min.4.3000rpm，5min,移去上清。5.加入0.5mlwash-buffer洗滌細(xì)胞一次。6.重復(fù)步驟4和步驟5.7.流式細(xì)
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類型檢測(cè)名稱檢測(cè)方法主要特點(diǎn)體內(nèi)功能檢驗(yàn)遲發(fā)型超敏反應(yīng)法皮下注射抗原或者負(fù)載抗原的DC，觀察紅斑、硬塊的發(fā)生與大小優(yōu)點(diǎn)：體內(nèi)功能性檢驗(yàn)，相對(duì)比較容易操作；缺點(diǎn)：只是一種初篩，加陽(yáng)性與假陰性比較嚴(yán)重。體外表型檢測(cè)TCR可變區(qū)分析法使用針對(duì)T細(xì)胞受體（TCR）可變區(qū)的流式抗體來(lái)對(duì)表達(dá)特定可變區(qū)的T細(xì)胞計(jì)數(shù)優(yōu)點(diǎn)：可以提供關(guān)于可變區(qū)使用的群體分布；缺點(diǎn)：識(shí)別同一種抗原的TCR的可變區(qū)可能不相同；單抗不夠豐富，不能檢測(cè)所有種類的可變區(qū)。多肽MHC四聚體法（Tetramer）用熒光標(biāo)記的MHC-肽四聚體去結(jié)
