雜質測試的適當標準是分析測試的重要組成部分。本文概述了美國藥典（USP）規(guī)定的內毒素標準的各種要求，并詳細闡述了內毒素與其他細胞成分不同的定義。

內毒素或脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性菌外膜 （OM）外葉（OL）的組成部分。它是一種獨-特的分子，被后生動物免疫系統(tǒng)用作原核生物入侵的標記，并作為多種革蘭氏陰性菌OM成分（包括磷脂和表面蛋白）中的單一成分出現(xiàn)。 

LPS根據(jù)USP參考標準質量要求從其他雜質中純化出來。  高度純化的材料被用作標準內毒素 （RSE/CSE），它在歷-史-上一直用于分析定義內毒素。在工業(yè)上，有些人希望為各種目的制備一種非純化的或“天然的標準品"，并將這些制劑稱為“天然內毒素"。本文概述了美國藥典（USP）1規(guī)定的一些標準要求，并詳細闡述了內毒素與其他細胞成分不同的定義。 

一、標準化

USP 40一般要求<11>的摘錄指出：

“美國藥典公約（USP標準物質或RS）提供的標準物質是反映特定藥物和食品（原料藥、生物制劑、賦形劑、膳食補充劑、食品成分、雜質、降解產物、試劑和性能驗證標準品）的高度表征本。當批準適合用作USP或國家處方集 （NF） 中文件測試或化驗的比較標準（即，作為專著組成部分）時，USP RS也在美國獲得官-方地位和法律認可。

USP <11> 的“雜質參考標準"部分指出：“雜質參考標準可以作為純化的單一組分材料或作為多種雜質的混合物出現(xiàn)。" 工業(yè)界要維持當前的“內毒素"標準（BET <85>），而不是“革蘭氏陰性細胞壁"標準，必須對其進行純化和高度表征，否則它將成為“混合雜質"標準，并被貼上這樣的標簽。

圖1：分解成相關組成部分的內毒素定義

二、內毒素的定義

鑒于本文的簡短性質，只能提供LPS定義的初步草圖（圖1）。主題將僅限于與內毒素標準化相關的項目：

1. LPS生物合成；

2. 宿主反應的相互特異性；

3. 革蘭氏陰性菌外膜的不對稱性；

4. 對比成分。

1. LPS 生物合成

內毒素在自然界中并非隨機發(fā)生；它是細菌制造過程的產物，該過程涉及九個獨立的酶促事件，然后輸出到革蘭氏陰性細菌細胞表面。LPS中獨-特的糖包括核心糖、KDO（3脫氧-α-D-甘露醇辛酮酸糖）和O抗原部分中糖的獨-特排列，用于在表征各種革蘭氏陰性細菌食源性疾病暴發(fā)（血清分型）時區(qū)分細菌菌株。 

圖2：LPS獨-特的結構定義3

獨-特的LPS結構以及相關的糖殘留物和排列如圖2所示。用于“建構"LPS的酶級聯(lián)，如細菌基因組中編碼的那樣，沒有顯示，但Wang和Quinn進行了廣泛的詳細說明，并支持LPS是一個特定的功能單元。2

2.宿主反應的相互特異性 

后生動物系統(tǒng)已經(jīng)通過其非常具體的反應定義了內毒素。然而，并非所有后生動物的反應都是相同的。幾十年來，基于鱟的測試一直是支持藥物測試的有效分析替代品。哺乳動物反應的特異性是極-端的。通過脂多糖結合蛋白（LBP）從聚集體中選擇（純化）LPS的單個分子，或者可能作為單體，其中已發(fā)現(xiàn)血清白蛋白可代替LBP。4分離后，LPS分子被轉移到位于TLR4中的MD-2，并引發(fā)跨膜信號事件。這大約是分子所能達到的“純化"程度。TLR4不僅對分子進行測量，而且還根據(jù)亞分子部分的潛在差異發(fā)出響應信號。

圖3：革蘭氏陰性菌的LPS激活宿主先天免疫反應。Ryu等人研究了LBP-CD14介導的LPS轉移到TLR4-MD-2至單分子分辨率的動態(tài)中間體。5

斷言LPS本質上是“未純化的"似乎是語義問題；它在其生物合成中以單一分子開始，在哺乳動物受體中作為單一分子結束。出于哺乳動物檢測的目的，它已通過當前的分析方法盡可能地純化。請參閱圖3 中（規(guī)范的）哺乳動物檢測級聯(lián)的概述。6

3. 革蘭氏陰性菌外膜的不對稱性

從能量上講，革蘭氏陰性菌的作用是維持與革蘭氏陰性菌外膜相關的不對稱性。這保持了一個有效的屏障，防止疏水性“斑塊"的形成，疏水“斑塊"可能允許不需要的物質（即抗生素）不加選擇地通過。這是治療革蘭氏陰性菌感染困難的原因之一。如果我們看一下常見的革蘭氏陰性菌表面的常見教科書圖，就會清楚地看到“不對稱"發(fā)生的位置（圖4）。6

圖4：革蘭氏陰性和陽性細菌的細胞壁結構6

由于革蘭氏陰性菌外膜外葉由LPS組成，而內葉由磷脂 （PL） 組成，因此會發(fā)生不對稱性。7如果外葉中聚集了足夠的磷脂，則細胞有專門的方法來重建不對稱性；包括“漂浮"在新的LPS分子中。8內毒素作為單一分子實體的長期定義包括其形成這種不對稱屏障的獨-特能力。因此，磷脂和LPS作為單獨的革蘭氏陰性菌外膜（圖3）的比例是一個重要的屬性。   

4.對比成分

有時，通過描述它不是什么而不是它是什么來定義某物更容易。內毒素不包括其他膜相關分子。它是六種無法通過其他方式檢測到的細菌殘留物的質量或分析標志物，因此是制藥生產中的關鍵質量屬性。一種與LPS共享革蘭氏陰性表面的革蘭氏陰性菌外膜成分類型是“孔蛋白"。孔蛋白是蛋白質結構，通常以三聚體形式存在，可調節(jié)水、溶質和營養(yǎng)物質進出細胞的通道。 

圖5：反硝化菌胞外表面的高分辨率分析。
A） 膜區(qū)域密集排列著孔蛋白三聚體。
B） 在高分辨率下，子結構在單個三聚體上可見。9

革蘭氏陰性菌外膜的概念最近發(fā)生了變化，因為對活細菌的原子力顯微鏡（AFM） 研究發(fā)現(xiàn)了主導革蘭氏陰性菌表面的孔（圖5）。9這些編織的蛋白質鏈形成空心的“管"，從表面向下延伸穿過外膜并進入細胞質（圖6D和E）。LPS通過基于鱟的測試提醒制造商注意革蘭氏陰性菌的存在；然而，孔蛋白目前還無法被檢測到。 

圖6：革蘭氏陰性菌外膜9中孔蛋白的天然超分子組裝的原子模型

使用原子力顯微鏡（AFM），Oestreicher等人。10研究了來自大腸桿菌和類球紅細菌的兩種典型革蘭氏陰性細菌結構，并指出：“我們的研究清楚地表明，這兩種類型的細胞都有一個外表面，該外表面覆蓋著類似于分枝桿菌的納米大小的孔網(wǎng)絡。" 與LPS一樣，孔蛋白是獨立的持久結構，具有免疫反應性且難以破壞。“孔蛋白是極其堅固的蛋白質，可以在70°C的5M鹽酸胍或2%SDS存在的情況下可以抵抗變性。" 11鑒于孔蛋白本質上具有免疫原性，因此應該引起人們的興趣。12,13 

雖然它不會改變LPS作為強效污染物的作用，但它清楚地表明LPS并不代表整個革蘭氏陰性菌表面，其革蘭氏陰性菌外膜而是由幾種離散物質組成。 

三、總結

內毒素的詳細定義支持純化LPS作為標準化雜質（RSE/CSE）的歷史和持續(xù)使用：

（a）內毒素是一種具有特殊組裝的獨-特結構（九個酶促步驟）；

（b）后生動物對LPS的反應（通過TLR4）的特異性與其他反應（例如激活TLR2 的孔蛋白或激活TLR5的鞭毛）是分開的；

（c）它包括內毒素在產生和維持革蘭氏陰性菌外膜與磷脂成比例的不對稱性方面的作用

（d）它作為與其他外膜結構分開和相鄰的單一結構存在，在結構、功能和免疫反應（TLR激活）方面提供了對比。

應努力開發(fā)新的測試方法來檢測重要的非LPS膜成分。這形成了一個關鍵的區(qū)別。與其設計一種由未純化的“細胞壁"成分組成且只能檢測到內毒素的“天然內毒素"，不如設計一種由未純化的“細胞壁"成分組成的“天然內毒素"，單個成分（內毒素、磷脂、孔蛋白、鞭毛蛋白等）應該有自己的檢測方法和標準，作為擴大微生物污染控制能力。這將提供必要的冗余，而目前檢測亞細胞革蘭氏陰性細菌假象的全部權重都落在了內毒素上。

雜質測試的適當標準是分析測試的重要組成部分。根據(jù)USP <11>，標記為“天然內毒素"的雜質混合物不是內毒素，而是可能含有內毒素、蛋白質、磷脂、核酸和孔蛋白的混合物。今天基于鱟的測試是針對內毒素的，而不是針對非內毒素的細胞壁或細胞質成分；這種特異性在鱟C因子和哺乳動物TLR4檢測架構中都是固有的。內毒素的定義是一個跨學科的定義，不能隨便重新定義。 

參考文獻

1. USP40-NF35 (Official as of 1-May-2018)

2. Wang X, Quinn, PJ. Lipopolysaccharide: Biosynthetic pathway and structure modification. Progress in Lipid Research 2010; 49: 97–107.

3. Ranf S. Immune Sensing of Lipopolysaccharide in Plants and Animals: Same but Different, PLOS Pathogens 2016.

4. Esparza et al. Endotoxin-albumin complexes transfer endotoxin monomers to MD-2 resulting in activation of TLR4, Innate Immunity, Innate Immun. 2012. 18(3): 478–491.

5. Ryu et al. Reconstruction of LPS transfer cascade reveals structural determinants within LBP, CD14, and TLR4-MD2 for efficient LPS recognition and transfer. Immunity 2017. 46, 38–50.

6. Berezin et al. Replacing a Century Old Technique – Modern Spectroscopy Can Supplant Gram Staining. Scientific Reports 2017. 7: 3810.

7. Henderson et al. The Power of Asymmetry: Architecture and Assembly of the Gram-Negative Outer Membrane Lipid Bilayer. Annu. Rev. Microbiol. 2016. 70:255–78. 

8. Ursell et al. Analysis of Surface Protein Expression Reveals the Growth Pattern of the Gram-Negative Outer Membrane. PLoS Comput Biol., v.8(9); 2012 Sept. PMC3459847`

9. Jaroslawski et al. High-resolution architecture of the outer membrane of Gram-negative bacteria Roseobacter denitrificans, Molecular Microbiology 2009. 74(5), 1211–1222.

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12. Liu et al. Immunogenic characterization of outer membrane porins OmpC and OmpF of porcine extraintestinal pathogenic Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 2012. 337: 104–111.

13. Pérez-Toledo M. Salmonella Typhi Porins OmpC and OmpF Are Potent Adjuvants for T-Dependent and T-Independent Antigens. Front Immunol. 2017. 8: 230.