一步法 TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒（紅色熒光）
MCE 國際站：One Step TUNEL Apoptosis Detection Kit (Cyanine 3)
品牌：MedChemExpress (MCE)
存儲條件： -20℃ 保存一年避光保存
簡介：MCE 一步法 TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒采用一步染色的方法快速檢測細胞凋亡。染色后，正常細胞基本無熒光，凋亡細胞呈紅色熒光。
概述：MCE一步法 TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒采用一步染色的方法快速檢測細胞凋亡。細胞凋亡時,相關DNA內切酶被激活,進而切斷核小體間的基因組DNA,產生 180-200 bp的 DNA ladder,其暴露的 3'-0H 經末端脫氧核苷酸轉移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)催化后可加上紅色熒光探針Cy3 (Cyanine3)標記的 dUTP,借助熒光顯微鏡或流式細胞儀即可檢測細胞凋亡的發生。Cy3 最大激發波長為550 nm,最大發射波長為570 nm。凋亡細胞顯示紅色熒光,正常細胞無熒光。
描述：
MCE一步法TUNEL凋亡檢測試劑盒（Cyanine 3）提供了一種快速、方便的檢測細胞凋亡的方法。細胞發生凋亡時，特異性的DNA內切酶會被激活，將基因組DNA在核小體之間切割。凋亡細胞的DNA被切割成180-200 bp片段的多聚體。斷裂的DNA暴露的3'-OH可被熒光素標記的dUTP末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT）催化，然后用熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測。Cy3（Cyanine 3）的最大激發波長和發射波長分別為550 nm和570 nm。
操作說明：樣品準備1.1貼壁細胞:a.洗滌:棄去培養基,加入PBS 洗滌2次,每次5分鐘。b.固定:加入固定液4℃固定30分鐘。c.洗滌:加入 PBS 洗滌 2次,每次5分鐘。輕輕棄去 PBS,并用濾紙吸去多余的液體。d.通透:加入通透液室溫孵育5分鐘。e.洗滌:加入 PBS 洗滌 2 次,每次5分鐘。輕輕棄去PBS,并用濾紙吸去多余的液體。1.2懸浮細胞:a.洗滌:離心收集細胞(不超過2X106個細胞),加入PBS 洗滌2次,每次5分鐘。b.固定:加入固定液4℃固定30分鐘。注:建議置于搖床上固定,以防止細胞聚團。c.洗滌:加入 PBS 洗滌2次,每次5分鐘。輕輕棄去PBS,并用濾紙吸去多余的液體。d.通透:加入通透液室溫孵育5分鐘。e.洗滌:加入 PBS 洗滌2次,每次5分鐘。輕輕棄去PBS,并用濾紙吸去多余的液體。1.3 石蠟切片:a.脫蠟:室溫下將石蠟切片置于二甲苯中脫蠟5-10分鐘,重復兩次。b.水化:用無水乙醇浸泡5分鐘,重復兩次。隨后用梯度乙醇(90%、80%、70%)依次浸泡2分鐘。c.洗滌:加入PBS 洗滌2次,每次5分鐘。輕輕棄去PBS,并用濾紙吸去多余的液體。d.通透:加入適量蛋白酶K溶液,室溫孵育 15-30分鐘。注:需自行優化蛋白酶K溶液孵育的溫度和時間。e.洗滌:加入 PBS 洗滌2次,每次5分鐘,除盡蛋白酶K,并用濾紙吸去多余的液體。1.4 冰凍切片a.固定:將冰凍切片回溫至室溫。加入固定液4℃ 固定30-60分鐘。b.洗滌:加入 PBS 洗滌2次,每次10分鐘。輕輕棄去 PBS,并用濾紙吸去多余的液體。C.通透:加入通透液室溫孵育5分鐘。d.洗滌:加入 PBS 洗滌2次,每次10分鐘。輕輕棄去 PBS,并用濾紙吸去多余的液體。注:所有處理好的樣本建議置于濕盒中保持濕潤,切勿讓樣品干燥。配制 TUNEL 工作液注：配制好的 TUNEL 工作液禁止冷凍保存。標記與檢測對于貼壁細胞或組織切片:加入50μL TUNEL工作液,37℃避光孵育60分鐘。加入PBS 洗滌3次。加入抗熒光淬滅封片液(HY-K1042)封片后在熒光顯微鏡下觀察熒光效果。注:a.注意避免 TUNEL 工作液的蒸發。b.對于6孔板的每個孔,宜加入100μL TUNEL 工作液。c.若 TUNEL 反應過強,可用 TdT Dilution Buffer 將TdT Enzyme稀釋2-5 倍后再進行操作。對于懸浮細胞:加入50μL TUNEL工作液,37C避光孵育60 分鐘。加入PBS 洗滌3次。加入250-500 μL PBS 充分懸浮細胞,用流式細胞儀檢測或涂片后在熒光顯微鏡下觀察熒光效果。注:若 TUNEL 反應過強,可用 TdT Dilution Buffer 將TdT Enzyme 稀釋2-5 倍后再進行操作
注意事項：1.樣品通透前可用石蠟筆在樣品周圍描繪樣品輪廓,以便于后續通透處理。2.所有處理好的樣本建議置于濕盒中保持濕潤,切勿讓樣品干燥。3.固定懸浮細胞時,為防止細胞聚集成團,建議置于搖床中進行固定。4.配制 TUNEL 工作液時需充分混勻,現用現配,注意避光,禁止冷凍保存。5.熒光染料都存在淬滅的問題,染色后應盡快檢測熒光強度,且整個實驗過程盡量避光下進行。6.若 TUNEL 反應過強,可用 TdT Dilution Buffer 將TdT Enzyme 稀釋 2-5倍后再進行操作。7.本產品僅限于專業人員的科學研究用,不得用于臨床診斷或治療,不得用于食品或藥品。8.為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。
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