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NTA vs. IDA：NTA和IDA的區別和選擇
如果您正在使用固定化金屬親和層析（IMAC）純化蛋白，您使用的金屬離子很可能是通過次氮基三乙酸（NTA）或者亞氨基二乙酸(IDA)偶聯到樹脂基質上的。在眾多可用于IMAC的螯合配體中，NTA和IDA是常用的兩種。您更傾向于使用哪種螯合配體？您為何選擇該配體？這兩種配體有什么不同?為了幫助我們的客戶在充分了解產品的情況下做出訂購決定，我們以PureCube Ni-NTA 瓊脂糖和PureCube Ni-IDA 瓊脂糖為例，詳細介紹二者的異同。
兩種配體在結構上和化學上有何不同？
螯合配體如何影響蛋白結合載量？
金屬離子在瓊脂糖的親和能力和特異性中扮演什么角色？
NTA和IDA對氧化劑的反應如何？
樣品緩沖液中的螯合劑對NTA和IDA的影響有無不同？
NTA vs IDA: 兩個配體的說明
固定化金屬親和層析（IMAC）是一種常用的蛋白純化方法，尤其是純化帶多聚組氨酸標簽的重組蛋白。過渡金屬離子通過螯合配體被固定在基質上，金屬離子能與多聚組氨酸標簽相互作用，有效地將帶標簽的重組蛋白從樣品中純化出來。目前商品化的瓊脂糖中常用的兩種配體便是NTA和IDA。在這份使用說明中，我們從已發表文章和實驗中總結了兩種配體的區別以及優缺點，以便為您提供一些思路，使您選擇的瓊脂糖能得到優秀的純化結果。
利用金屬捕獲蛋白質
固定化金屬親和層析（IMAC）解決通常的一步蛋白純化
從1975年IMAC問世以來，IMAC以及它的變型和改良技術被廣泛地應用于蛋白純化領域。通常情況下，過渡金屬離子通過配體固定在基質上，與融合在肽段C-或N-末端的多聚組氨酸標簽（由3-10個組氨酸組成）上的咪唑基相互作用。這種相互作用可以有效地將蛋白質從溶液中分離出來，然后通過一定濃度梯度的咪唑洗脫液、改變pH或金屬螯合將結合的蛋白從金屬離子上洗脫下來。
IMAC的初始用于純化自身具有金屬離子親和性的天然蛋白質，現在已擴展到純化磷酸化蛋白，抗體以及一系列帶有多聚組氨酸標簽的蛋白質。多聚組氨酸標簽的突出優點在于它的體積較小，同時免疫原性很低，幾乎不會干擾到蛋白質的正常功能。三價或四價離子通常用于磷酸化蛋白的純化，而二價離子如Ni2+, Cu2+ 和 Zn2+一般用于純化帶組氨酸標簽的重組蛋白。
IMAC之所以能得到廣泛應用，不僅因為它價格低廉，操作簡單，還因為它非常穩定，在很多特殊的蛋白純化情況中也可以使用。例如，我們需要在非變性或變性條件下純化蛋白，或者在氧化及還原環境中純化蛋白，都可以使用IMAC。另外，IMAC可耐受多種化學物質。總而言之，IMAC還具有高親和性，高特異性和易放大性，這使得蛋白純化甚至是從粗裂解液中純化都變得非常有效。
不僅僅是蛋白純化
IMAC作為一種通用技術，其應用之廣，非常驚人。表面固定化組氨酸標記抗原可增加以ELISA為基礎的診斷工具的靈敏度。IMAC也可以介導功能域表面蛋白與蛋白相互作用的研究。在蛋白組學研究中，IMAC可用于預分離階段來減少對象樣品的復雜性。最后，利用螯合原理，樣品與耦聯螯合配體的基質一同孵育，配體可減少PCR的金屬離子抑制劑，因此能快速產生用于擴增的樣品。
選擇螯合配體：選擇哪一種？
配體的配位數對洗脫蛋白的產量和純度有影響
Porath和同事發明了第一個IMAC瓊脂糖實物，他們將金屬離子通過亞氨基二乙酸（IDA）固定到瓊脂糖上。現在商品化IMAC瓊脂糖仍廣泛使用IDA配體，次氮基三乙酸（NTA）在1987年被Hochuli和同事引入商品化IMAC中。在那之后，盡管有其他專用螯合配體(例如 TED, TALON®)陸續問世，但IDA和NTA一直代表常用的親和純化蛋白IMAC瓊脂糖。從結構上看，IDA與NTA的區別在于NTA多了一個羧甲基基團。從化學性質上看，額外的功能基團使得NTA與金屬離子的配位能力更強，因為NTA擁有四個效價，而IDA只有三個（圖1）。
圖1：IMAC螯合配體IDA和NTA. IDA和NTA廣泛用于將過渡態金屬離子結合到基質上，該整體可作為親和樹脂。這兩種配體與金屬離子結合的價態數目不同（IDA是三價而NTA是四價；價態用橙色標出），這會影響純化到的蛋白的質量。
當兩種配體都有兩個價位可以與組氨酸殘基的咪唑基相互作用時，配位數對純化到的蛋白質量有影響。首先，作為一個三價配體（配位數為3），IDA的金屬離子漏出率很高，尤其是在平衡和洗脫步驟。盡管NTA瓊脂糖的洗脫成分中也含有部分漏出的金屬離子，但明顯少于IDA樹脂。第二，由于目標蛋白性質的變化，用IDA瓊脂糖純化的帶組氨酸標簽的蛋白通常比用NTA瓊脂糖純化的純度低。圖2顯示在大腸桿菌中表達的綠色熒光蛋白，分別用PureCube Ni-IDA和PureCube Ni-NTA純化后的SDS-PAGE圖。IDA瓊脂糖純化的前三個洗脫成分中有清晰的非目的蛋白的裂解產物蛋白條帶。
圖2：在大腸桿菌中表達的綠色熒光蛋白，分別用PureCube Ni-IDA和PureCube Ni-NTA純化后的SDS-PAGE圖
然而，IDA也有其自身優勢，配有IDA配體的瓊脂糖通常價格稍低一些。另外，三價配體在洗脫蛋白時需要的咪唑溶液濃度比四價的NTA低。最后，IDA分子更小，可以更高的密度結合到基質上，因此能結合更多的金屬離子。通常來說，低裝載密度可提高目的蛋白純化質量降低目的蛋白純化產量；而高裝載密度可提高目的蛋白產量，但會增加非特異性結合。綜合考量IDA或NTA的裝載密度與不同金屬離子的親和性和特異性（圖3），可以提高特定蛋白的純化產量及質量。
圖3：IMAC常用金屬離子的相對親和性和特異性。一方面，銅親和力高從而純化蛋白產量高，但是特異性較低。另一方面，鈷親和力較低但特異性高，從而能減少洗脫液中非目的蛋白。
那么我們應該如何根據不同的蛋白選擇適合的配體和金屬離子呢，下期我們將詳細為您解答，敬請關注！
蛋白決定配體和金屬離子
當被問及為何選擇某種配體來純化帶組氨酸標簽的蛋白而不選擇另外一種時，大多數研究者都沒有明確的答案。然而，在純化過程中我們應該嘗試使用多種配體，因為IMAC瓊脂糖結合蛋白的能力與金屬離子的種類和被純化蛋白的性質密切相關，改變配體-離子組合有可能得到更好的純化效果。例如，通常IDA的金屬離子容量比NTA高（PureCube IDA 瓊脂糖Ni2+ 或 Cu2+濃度>25 μmol/mL，而PureCube NTA 瓊脂糖Ni2+ 或 Cu2+濃度>15 μmol/mL）。理論上說，IDA有更多的蛋白結合位點，蛋白產量應該更高，正如表1中的JNK1 和GFP，但是不同的蛋白具有不同的結合能力，所以有時產量可能會極低，例如白介素-1β。另外即便是對于同一個帶組氨酸標簽的蛋白，結合了不同金屬離子的瓊脂糖對其的親和性也是不同的。鈷的結合特異性高但親和性低（圖3），我們可以看到結合鈷的瓊脂糖蛋白載量更低（表1）。鎳的特異性低而親和性高，因此蛋白產量明顯更高。我們可以通探索不同的金屬離子和配體組合來優化帶組氨酸標簽蛋白的純化方法。不過需要注意的是，對所有的樹脂或所有的蛋白質來說，上述的趨勢并不是一成不變的。
表1：IMAC瓊脂糖的結合能力很大程度上取決于金屬離子和被純化蛋白的性質。對不同蛋白進行PureCube組氨酸親和瓊脂糖的標準質量控制測試。某些蛋白如GFP和JNK1產量高，而其他蛋白如白介素1β的產量較低。同時，瓊脂糖上裝載的金屬離子也影響結合能力。首先，鈷的蛋白結合特異性比鎳高，導致總體上較低的產量。其次，鈷與JNK1的相互作用比GFP強，而鎳剛好相反。
你的樣品中還有什么？
它會影響你選擇的標準
被研究樣品中的某些化合物的存在會影響IDA-瓊脂糖和NTA-瓊脂糖的結合能力。DTT（二硫蘇糖醇）是一種還原劑，可保護蛋白質的游離巰基不被氧化，破壞SDS-PAGE的樣品中的二硫鍵。DTT可還原IMAC瓊脂糖的金屬離子，通常會使瓊脂糖的顏色變為棕色。通過實驗比較發現，PureCube Ni-IDA 瓊脂糖和 PureCube Ni-NTA 瓊脂糖暴露在不同濃度的DTT溶液中時，兩種瓊脂糖的結合能力呈非線性比例下降，隨DTT濃度的增加，Ni-NTA表現出較慢的下降速率，為8%，而Ni-IDA為11.1%。10 mM DTT下Ni-NTA 和 Ni-IDA的結合能力總體下降為22%和30%。（圖4A）
EDTA對于結合能力的影響更為顯著。許多緩沖液中有這種六價螯合劑來減少金屬離子的干擾。我們的對照實驗顯示較高濃度EDTA中Ni-NTA比Ni-IDA更有活力。Ni-NTA的結合能力呈非線性降低，EDTA濃度達到1mM時總體下降了46%，之后略微下調。在EDTA濃度達到1mM前, Ni-IDA的結合能力下降幅度與Ni-NTA相似。然后結合能力劇烈下降。（總降低量：65%，圖4B）
圖4： Ni-NTA比Ni-IDA更能耐受還原劑和螯合劑，將PureCube Ni-NTA瓊脂糖和PureCube Ni-IDA瓊脂糖分別置于三種濃度的DTT(A)和EDTA(B)溶液中處理1h，然后分別用含有上述瓊脂糖的重力柱純化帶組氨酸標簽的GFP。兩種瓊脂糖的蛋白結合能力都下降，但Ni-NTA在兩種試劑處理后下降更為緩慢，尤其是在高濃度DTT和EDTA處理后。我們也觀察到PureCube Ni-NTA瓊脂糖在有DTT時沒有變成棕色（A的插圖）。誤差線為初次標準偏差（n=3）
NTA vs. IDA：做出正確的選擇
決定用何種IMAC瓊脂糖進行蛋白純化時需考慮以下問題：
*你需要目的蛋白的純度是多高？
*你需要目的蛋白的產量是多少？
*你的樣品中是否含有如DTT或EDTA之類的化學試劑？
*你的預算是多少？
*你對蛋白表達量的預期是多少？
如果你追求高產量，而對蛋白純度的要求并不高，那么可以選用IDA-瓊脂糖。它價格較低，性能穩定，易于再生以及再裝載金屬離子。為減少非特異性結合，可以嘗試使用其他金屬離子如鋅和鈷。如果對蛋白純度要求高的話（例如，為后續結晶做準備），NTA-瓊脂糖是很好的選擇。通過裝載特異性高的金屬離子（如鈷）可進一步提高瓊脂糖的特異性。NTA-瓊脂糖的另一個優點是對如DTT和EDTA之類試劑時有較高的耐受性，因此適用于多種樣品緩沖液。瓊脂糖種類的選擇也很重要，基質和純化流程會影響最終的結果。另外，純化蛋白時使用過量的瓊脂糖會導致純度降低，因為很多結合位點沒有和目的蛋白結合而暴露。
當純化少量蛋白時，我們推薦您使用磁珠作為基質；磁珠更適合用于純化稀釋樣品中的蛋白、低表達量的蛋白及pull-down實驗。如果從中等規模培養物中提取蛋白（>50 μg）推薦選用瓊脂糖批量純化或用重力柱純化，瓊脂糖也可放大用于大量的蛋白的純化。而預裝層析柱可用于蛋白的自動純化，載量為1-100mg。（圖5）
總的來說，如果要優化帶組氨酸標簽蛋白的純化過程，需要嘗試多種親和瓊脂糖，但只要遵循一定的原則，IMAC瓊脂糖的考察和選擇也是一個系統化的過程。
圖5：不同形式的IMAC適用于不同的蛋白產量。一般來說，蛋白含量低的樣品推薦選用磁珠，大量蛋白的純化推薦選用瓊脂糖。標出的蛋白量僅供參考。
這份說明的總結：
*IDA-瓊脂糖價格較低
*NTA-瓊脂糖洗脫下來的蛋白通常純度較高
*NTA-瓊脂糖的金屬離子漏出率明顯較低
*改變金屬離子可以改變瓊脂糖的結合特異性。Co2+ 離子特異性特別強，其次是Ni2+, Zn2+,最后是 Cu2+
*NTA-瓊脂糖抵抗還原劑和螯合劑的能力強
