Taq DNA Ligase連接酶是將 PCR 反應(yīng)用到的超保真 P6 DNA 聚合酶、buffer、dNTP Mixture 以及穩(wěn)定劑以 2倍的終濃度進(jìn)行混合。在 20 μL 的連接反應(yīng)體系中，6 μg 的 λDNA-HindIII 的分解物在 16℃下反應(yīng) 30 分鐘時，有 50%以上的 DNA 1段被 連接所需要的酶量定義為 1 個 活性單位 （U）。

 Taq DNA Ligase連接酶

單位定義

在 20 μL 的連接反應(yīng)體系中，6 μg 的 λDNA-HindIII 的分解物在 16℃下反應(yīng) 30 分鐘時，有 50%以上的 DNA 1段被 連接所需要的酶量定義為 1 個 活性單位 (U)。

質(zhì)量控制

核酸外切酶殘留檢測：將 2000 U 連接酶和 0.6 μg λ-Hind III 在 74℃下反應(yīng) 1 小時，DNA 的電泳譜帶不發(fā)生變化。

存儲條件

-20 ℃保存。

Taq DNA Ligase連接酶

1、連接反應(yīng)

1）于冰上配置如下反應(yīng)體系 2 × Fast T4 DNA Ligase buffer 10 μL 載體 0.03 pmol (即 20 ng/ kb 載體長度) 1段 0.03-0.3 pmol （適為 60 ng/ kb 外源長度） Fast T4 DNA Ligase 1 μL ddH2O To 20 μL

2）使用移液器輕輕吸打混勻(請勿振蕩混勻)，短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。

3）反應(yīng)條件：25℃反應(yīng) 5min；降至 4℃或立即置于冰上冷卻。當(dāng)進(jìn)行平滑末端或 TA 連接時， 可適當(dāng)延長反應(yīng)時間以提高連接效率，但建議不超過 2 h。

♦若使用 4℃或 16℃進(jìn)行連接，則建議連接過夜；

♦連接產(chǎn)物若需要電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，則需將連接產(chǎn)物進(jìn)行柱回收或乙醇沉淀法等處理以除去反應(yīng)液中的大量離子。

♦連接產(chǎn)物可于-20℃凍存一周，待需要時解凍轉(zhuǎn)化即可。

Taq DNA Ligase連接酶

1）將克隆用的化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞置于冰上解凍

2）取 5 - 10 μL 連接產(chǎn)物加入 100 μL感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰上靜置 30 min。

♦ 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化體積多不應(yīng)超過所用感受態(tài)細(xì)胞體積的 1/10；且切勿使用振蕩混勻。

3）42℃水浴熱激 90 sec 后，立即置于冰上冷卻 2 - 3 min。

4）加入 900 μL SOC 或 LB 液體培養(yǎng)基 (不添加抗生素)，37℃搖菌復(fù)壯 45 min。

5）將復(fù)壯后的菌液用 5,000 rpm離心 5 min，棄掉 900 μL上清，并用剩余培養(yǎng)液將菌體重懸；用 無菌涂布棒將菌液涂布在含有正確抗性的平板上，于 37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng) 12 - 16 h。

3、陽性克隆鑒定

菌落 PCR 鑒定；酶切鑒定；質(zhì)粒鑒定；測序分析。

產(chǎn)品簡介

Fast T4 DNA Ligase 是基于 T4 DNA Ligase 改造的快速連接酶，能夠催化雙鏈 DNA 或 RNA 上相鄰的 5´

-磷酸末端和 -羥基末端形成磷酸二酯鍵。本試劑盒不僅適用于黏性末端連接，也兼容平滑末端和單堿基突出末端的 DNA 連接， 優(yōu)化的連接增強(qiáng)劑及反應(yīng)緩沖液使反應(yīng)更加高效便捷，室溫（25℃）反應(yīng) 5 min 即可完成連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物也可 直接轉(zhuǎn)化多種化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞。

產(chǎn)品組成

Fast T4 DNA Ligase (400 U/μL) 100 μL 1 mL 2 × Fast T4 DNA Ligase buffer 1 mL    10 × 1 mL

單位定義

在 20 μL 的連接反應(yīng)體系中，6 μg 的 λDNA-HindIII 的分解物在 16℃下反應(yīng) 30 分鐘時，有 50%以上的 DNA 1段被 連接所需要的酶量定義為 1 個 活性單位 (U)。

質(zhì)量控制

核酸外切酶殘留檢測：將 2000 U 連接酶和 0.6 μg λ-Hind III 在 74℃下反應(yīng) 1 小時，DNA 的電泳譜帶不發(fā)生變化。

存儲條件

-20 ℃保存。

實(shí)驗(yàn)流程

1、連接反應(yīng)

1）于冰上配置如下反應(yīng)體系 2 × Fast T4 DNA Ligase buffer 10 μL 載體 0.03 pmol (即 20 ng/ kb 載體長度) 1段 0.03-0.3 pmol （適為 60 ng/ kb 外源長度） Fast T4 DNA Ligase 1 μL ddH2O To 20 μL

2）使用移液器輕輕吸打混勻(請勿振蕩混勻)，短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。

3）反應(yīng)條件：25℃反應(yīng) 5min；降至 4℃或立即置于冰上冷卻。當(dāng)進(jìn)行平滑末端或 TA 連接時， 可適當(dāng)延長反應(yīng)時間以提高連接效率，但建議不超過 2 h。

♦若使用 4℃或 16℃進(jìn)行連接，則建議連接過夜；

♦連接產(chǎn)物若需要電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，則需將連接產(chǎn)物進(jìn)行柱回收或乙醇沉淀法等處理以除去反應(yīng)液中的大量離子。

♦連接產(chǎn)物可于-20℃凍存一周，待需要時解凍轉(zhuǎn)化即可。

2、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化

1）將克隆用的化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞置于冰上解凍

2）取 5 - 10 μL 連接產(chǎn)物加入 100 μL感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰上靜置 30 min。

♦ 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化體積多不應(yīng)超過所用感受態(tài)細(xì)胞體積的 1/10；且切勿使用振蕩混勻。

3）42℃水浴熱激 90 sec 后，立即置于冰上冷卻 2 - 3 min。

4）加入 900 μL SOC 或 LB 液體培養(yǎng)基 (不添加抗生素)，37℃搖菌復(fù)壯 45 min。

5）將復(fù)壯后的菌液用 5,000 rpm離心 5 min，棄掉 900 μL上清，并用剩余培養(yǎng)液將菌體重懸；用 無菌涂布棒將菌液涂布在含有正確抗性的平板上，于 37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng) 12 - 16 h。

3、陽性克隆鑒定

菌落 PCR 鑒定；酶切鑒定；質(zhì)粒鑒定；測序分析。

產(chǎn)品簡介

Fast T4 DNA Ligase 是基于 T4 DNA Ligase 改造的快速連接酶，能夠催化雙鏈 DNA 或 RNA 上相鄰的 5´

-磷酸末端和 -羥基末端形成磷酸二酯鍵。本試劑盒不僅適用于黏性末端連接，也兼容平滑末端和單堿基突出末端的 DNA 連接， 優(yōu)化的連接增強(qiáng)劑及反應(yīng)緩沖液使反應(yīng)更加高效便捷，室溫（25℃）反應(yīng) 5 min 即可完成連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物也可 直接轉(zhuǎn)化多種化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞。

產(chǎn)品組成

Fast T4 DNA Ligase (400 U/μL) 100 μL 1 mL 2 × Fast T4 DNA Ligase buffer 1 mL    10 × 1 mL

單位定義

在 20 μL 的連接反應(yīng)體系中，6 μg 的 λDNA-HindIII 的分解物在 16℃下反應(yīng) 30 分鐘時，有 50%以上的 DNA 1段被 連接所需要的酶量定義為 1 個 活性單位 (U)。

質(zhì)量控制

核酸外切酶殘留檢測：將 2000 U 連接酶和 0.6 μg λ-Hind III 在 74℃下反應(yīng) 1 小時，DNA 的電泳譜帶不發(fā)生變化。

存儲條件

-20 ℃保存。

實(shí)驗(yàn)流程

1、連接反應(yīng)

1）于冰上配置如下反應(yīng)體系 2 × Fast T4 DNA Ligase buffer 10 μL 載體 0.03 pmol (即 20 ng/ kb 載體長度) 1段 0.03-0.3 pmol （適為 60 ng/ kb 外源長度） Fast T4 DNA Ligase 1 μL ddH2O To 20 μL

2）使用移液器輕輕吸打混勻(請勿振蕩混勻)，短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。

3）反應(yīng)條件：25℃反應(yīng) 5min；降至 4℃或立即置于冰上冷卻。當(dāng)進(jìn)行平滑末端或 TA 連接時， 可適當(dāng)延長反應(yīng)時間以提高連接效率，但建議不超過 2 h。

♦若使用 4℃或 16℃進(jìn)行連接，則建議連接過夜；

♦連接產(chǎn)物若需要電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，則需將連接產(chǎn)物進(jìn)行柱回收或乙醇沉淀法等處理以除去反應(yīng)液中的大量離子。

♦連接產(chǎn)物可于-20℃凍存一周，待需要時解凍轉(zhuǎn)化即可。

2、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化

1）將克隆用的化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞置于冰上解凍

2）取 5 - 10 μL 連接產(chǎn)物加入 100 μL感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰上靜置 30 min。

♦ 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化體積多不應(yīng)超過所用感受態(tài)細(xì)胞體積的 1/10；且切勿使用振蕩混勻。

3）42℃水浴熱激 90 sec 后，立即置于冰上冷卻 2 - 3 min。

4）加入 900 μL SOC 或 LB 液體培養(yǎng)基 (不添加抗生素)，37℃搖菌復(fù)壯 45 min。

5）將復(fù)壯后的菌液用 5,000 rpm離心 5 min，棄掉 900 μL上清，并用剩余培養(yǎng)液將菌體重懸；用 無菌涂布棒將菌液涂布在含有正確抗性的平板上，于 37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng) 12 - 16 h。

3、陽性克隆鑒定

菌落 PCR 鑒定；酶切鑒定；質(zhì)粒鑒定；測序分析。