Fast T4 DNA Ligase連接酶是將 PCR 反應用到的超保真 P6 DNA 聚合酶、buffer、dNTP Mixture 以及穩定劑以 2倍的終濃度進行混合。在 20 μL 的連接反應體系中，6 μg 的 λDNA-HindIII 的分解物在 16℃下反應 30 分鐘時，有 50%以上的 DNA 1段被 連接所需要的酶量定義為 1 個 活性單位 （U）。

  Fast T4 DNA Ligase連接酶

單位定義

在 20 μL 的連接反應體系中，6 μg 的 λDNA-HindIII 的分解物在 16℃下反應 30 分鐘時，有 50%以上的 DNA 1段被 連接所需要的酶量定義為 1 個 活性單位 (U)。

質量控制

核酸外切酶殘留檢測：將 2000 U 連接酶和 0.6 μg λ-Hind III 在 74℃下反應 1 小時，DNA 的電泳譜帶不發生變化。

存儲條件

-20 ℃保存。

Fast T4 DNA Ligase連接酶

1、連接反應

1）于冰上配置如下反應體系 2 × Fast T4 DNA Ligase buffer 10 μL 載體 0.03 pmol (即 20 ng/ kb 載體長度) 1段 0.03-0.3 pmol （適為 60 ng/ kb 外源長度） Fast T4 DNA Ligase 1 μL ddH2O To 20 μL

2）使用移液器輕輕吸打混勻(請勿振蕩混勻)，短暫離心將反應液收集至管底。

3）反應條件：25℃反應 5min；降至 4℃或立即置于冰上冷卻。當進行平滑末端或 TA 連接時， 可適當延長反應時間以提高連接效率，但建議不超過 2 h。

♦若使用 4℃或 16℃進行連接，則建議連接過夜；

♦連接產物若需要電轉化感受態細胞，則需將連接產物進行柱回收或乙醇沉淀法等處理以除去反應液中的大量離子。

♦連接產物可于-20℃凍存一周，待需要時解凍轉化即可。

Fast T4 DNA Ligase連接酶

1）將克隆用的化學感受態細胞置于冰上解凍

2）取 5 - 10 μL 連接產物加入 100 μL感受態細胞中，輕輕混勻，冰上靜置 30 min。

♦ 連接產物轉化體積多不應超過所用感受態細胞體積的 1/10；且切勿使用振蕩混勻。

3）42℃水浴熱激 90 sec 后，立即置于冰上冷卻 2 - 3 min。

4）加入 900 μL SOC 或 LB 液體培養基 (不添加抗生素)，37℃搖菌復壯 45 min。

5）將復壯后的菌液用 5,000 rpm離心 5 min，棄掉 900 μL上清，并用剩余培養液將菌體重懸；用 無菌涂布棒將菌液涂布在含有正確抗性的平板上，于 37℃培養箱中倒置培養 12 - 16 h。

3、陽性克隆鑒定

菌落 PCR 鑒定；酶切鑒定；質粒鑒定；測序分析。

產品簡介

Fast T4 DNA Ligase 是基于 T4 DNA Ligase 改造的快速連接酶，能夠催化雙鏈 DNA 或 RNA 上相鄰的 5´

-磷酸末端和 -羥基末端形成磷酸二酯鍵。本試劑盒不僅適用于黏性末端連接，也兼容平滑末端和單堿基突出末端的 DNA 連接， 優化的連接增強劑及反應緩沖液使反應更加高效便捷，室溫（25℃）反應 5 min 即可完成連接反應，連接產物也可 直接轉化多種化學感受態細胞。

產品組成

Fast T4 DNA Ligase (400 U/μL) 100 μL 1 mL 2 × Fast T4 DNA Ligase buffer 1 mL    10 × 1 mL

單位定義

在 20 μL 的連接反應體系中，6 μg 的 λDNA-HindIII 的分解物在 16℃下反應 30 分鐘時，有 50%以上的 DNA 1段被 連接所需要的酶量定義為 1 個 活性單位 (U)。

質量控制

核酸外切酶殘留檢測：將 2000 U 連接酶和 0.6 μg λ-Hind III 在 74℃下反應 1 小時，DNA 的電泳譜帶不發生變化。

存儲條件

-20 ℃保存。

實驗流程

1、連接反應

1）于冰上配置如下反應體系 2 × Fast T4 DNA Ligase buffer 10 μL 載體 0.03 pmol (即 20 ng/ kb 載體長度) 1段 0.03-0.3 pmol （適為 60 ng/ kb 外源長度） Fast T4 DNA Ligase 1 μL ddH2O To 20 μL

2）使用移液器輕輕吸打混勻(請勿振蕩混勻)，短暫離心將反應液收集至管底。

3）反應條件：25℃反應 5min；降至 4℃或立即置于冰上冷卻。當進行平滑末端或 TA 連接時， 可適當延長反應時間以提高連接效率，但建議不超過 2 h。

♦若使用 4℃或 16℃進行連接，則建議連接過夜；

♦連接產物若需要電轉化感受態細胞，則需將連接產物進行柱回收或乙醇沉淀法等處理以除去反應液中的大量離子。

♦連接產物可于-20℃凍存一周，待需要時解凍轉化即可。

2、連接產物轉化

1）將克隆用的化學感受態細胞置于冰上解凍

2）取 5 - 10 μL 連接產物加入 100 μL感受態細胞中，輕輕混勻，冰上靜置 30 min。

♦ 連接產物轉化體積多不應超過所用感受態細胞體積的 1/10；且切勿使用振蕩混勻。

3）42℃水浴熱激 90 sec 后，立即置于冰上冷卻 2 - 3 min。

4）加入 900 μL SOC 或 LB 液體培養基 (不添加抗生素)，37℃搖菌復壯 45 min。

5）將復壯后的菌液用 5,000 rpm離心 5 min，棄掉 900 μL上清，并用剩余培養液將菌體重懸；用 無菌涂布棒將菌液涂布在含有正確抗性的平板上，于 37℃培養箱中倒置培養 12 - 16 h。

3、陽性克隆鑒定

菌落 PCR 鑒定；酶切鑒定；質粒鑒定；測序分析。

產品簡介

Fast T4 DNA Ligase 是基于 T4 DNA Ligase 改造的快速連接酶，能夠催化雙鏈 DNA 或 RNA 上相鄰的 5´

-磷酸末端和 -羥基末端形成磷酸二酯鍵。本試劑盒不僅適用于黏性末端連接，也兼容平滑末端和單堿基突出末端的 DNA 連接， 優化的連接增強劑及反應緩沖液使反應更加高效便捷，室溫（25℃）反應 5 min 即可完成連接反應，連接產物也可 直接轉化多種化學感受態細胞。

產品組成

Fast T4 DNA Ligase (400 U/μL) 100 μL 1 mL 2 × Fast T4 DNA Ligase buffer 1 mL    10 × 1 mL

單位定義

在 20 μL 的連接反應體系中，6 μg 的 λDNA-HindIII 的分解物在 16℃下反應 30 分鐘時，有 50%以上的 DNA 1段被 連接所需要的酶量定義為 1 個 活性單位 (U)。

質量控制

核酸外切酶殘留檢測：將 2000 U 連接酶和 0.6 μg λ-Hind III 在 74℃下反應 1 小時，DNA 的電泳譜帶不發生變化。

存儲條件

-20 ℃保存。

實驗流程

1、連接反應

1）于冰上配置如下反應體系 2 × Fast T4 DNA Ligase buffer 10 μL 載體 0.03 pmol (即 20 ng/ kb 載體長度) 1段 0.03-0.3 pmol （適為 60 ng/ kb 外源長度） Fast T4 DNA Ligase 1 μL ddH2O To 20 μL

2）使用移液器輕輕吸打混勻(請勿振蕩混勻)，短暫離心將反應液收集至管底。

3）反應條件：25℃反應 5min；降至 4℃或立即置于冰上冷卻。當進行平滑末端或 TA 連接時， 可適當延長反應時間以提高連接效率，但建議不超過 2 h。

♦若使用 4℃或 16℃進行連接，則建議連接過夜；

♦連接產物若需要電轉化感受態細胞，則需將連接產物進行柱回收或乙醇沉淀法等處理以除去反應液中的大量離子。

♦連接產物可于-20℃凍存一周，待需要時解凍轉化即可。

2、連接產物轉化

1）將克隆用的化學感受態細胞置于冰上解凍

2）取 5 - 10 μL 連接產物加入 100 μL感受態細胞中，輕輕混勻，冰上靜置 30 min。

♦ 連接產物轉化體積多不應超過所用感受態細胞體積的 1/10；且切勿使用振蕩混勻。

3）42℃水浴熱激 90 sec 后，立即置于冰上冷卻 2 - 3 min。

4）加入 900 μL SOC 或 LB 液體培養基 (不添加抗生素)，37℃搖菌復壯 45 min。

5）將復壯后的菌液用 5,000 rpm離心 5 min，棄掉 900 μL上清，并用剩余培養液將菌體重懸；用 無菌涂布棒將菌液涂布在含有正確抗性的平板上，于 37℃培養箱中倒置培養 12 - 16 h。

3、陽性克隆鑒定

菌落 PCR 鑒定；酶切鑒定；質粒鑒定；測序分析。