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使用功能性OCT對腫瘤微血管進行臨床前成像研究
放射療法廣泛用于癌癥治療，目前技術朝著以更少的分割提供更高劑量發展，但這可能會引起細胞和微血管損傷。微血管系統可能是放療早期應答的功能生物標志物，然而很難直接且非侵入地測量微血管應答情況，其時間進程、劑量依賴性和在腫瘤控制中的總體重要性也尚不清楚。針對這種情況，加拿大研究人員Valentin Demidov等使用功能性OCT，結合人腫瘤異種移植物臨床前模型，對單次10、20和30 Gy放射劑量下腫瘤的微血管應答情況進行了體內縱向定量成像研究，對放療后血管重塑進行了詳細評估。定量評估了微血管對放療的即時（幾分鐘至幾十分鐘）和早期（幾天至幾周）應答、腫瘤體積及熒光強度，與文獻報道過的理論模型進行了比較討論，發現這些放療應答雖穩定但很復雜，且隨時間呈劑量依賴性。該研究成果以“Preclinical longitudinal imaging of tumor microvascular radiobiologicalresponse with functional optical coherence tomography"為題發表于SCIENTIfIC REPORTS。
背景
放射療法（radiation therapy, RT）廣泛應用于癌癥治療中。靶向腫瘤癌細胞的常見臨床劑量為每分割2 Gy，每天給藥，持續5-6周，總累積劑量為50-70 Gy，目前認為這種分割方案是臨床xiaoguozuihao的。放射治療傳遞和放射生物學腫瘤效應監測方面取得的成果促進了立體定向放射療法（stereotactic body radiation therapy, SBRT）的發展，該療法能以更少分割及每分割更高劑量來提高對腫瘤內的局部控制，并降低對周圍正常組織的損傷。
有臨床前研究證明，較高劑量的輻射能通過腫瘤微血管損介導的“非經典"放射生物學機制，誘導更多腫瘤細胞死亡。具體來說，Fuks和Kolesnick認為這種抗腫瘤能力的提升歸因于血管損傷，且需要的最小閾值劑量為約8-10 Gy。同樣，接受高劑量放療的腫瘤反應高于現有的生物學模型預測的水平。這可能與腫瘤中活躍的血管新生有關，血管新生過程中血管內皮細胞增殖速率顯著增加，可能使腫瘤脈管系統對電離輻射更加敏感。據報道，腫瘤內皮細胞的死亡會啟動炎癥級聯反應，產生缺氧、酸性和營養缺乏的微環境，會使輻射的毒性增強。
盡管進行了大量研究，但大劑量放療后的腫瘤應答的潛在生物學機制仍不明確。對于放療后不同階段的血管變化動力學、腫瘤血管的組織性、血管生成和新血管形成情況也知之甚少。主要還是因為無法從毛細管水平對這些動力學應答進行原位研究。結合針對40多項臨床前研究的綜述發現，放療微血管應答方面缺乏實驗共識，不同實驗方案（動物模型、細胞系、x射線能量、劑量水平）、不同成像和定量技術（離體免疫組化、多普勒超聲和體內計算機斷層掃描等）得到的數據相互矛盾。雖然針對放療血管應答效果提出了幾個理論上的機制模型，但幾乎沒有直接的體內實驗數據能來支持和驗證這些模型。了解腫瘤微脈管系統對放療的應答機制，不但有可能實現個性化放療，同時還有助于幫助改善SBRT等更大程度涉及腫瘤微脈管系統的高劑量的放療方法的應用。
已知腫瘤毛細血管對輻射特別敏感，但大多數成像方式（超聲、磁共振成像、共聚焦熒光顯微鏡等）的分辨能力達不到要求，或需造影劑才能實現可視化及縱向監測其反應。本研究利用功能性光學相干斷層掃描（OCT）來研究腫瘤微脈管系統對放射治療的應答。OCT是一種無標記無創3D光學成像方式，用于活體觀察皮下組織細節，并能在微循環水平觀察血流細節。OCT還具有很強的擴展性，如散斑方差光學相干斷層掃描（svOCT），能夠對活體微血管進行三維深度分辨成像。svOCT圖像的內源性對比度源于血管內的血液和周圍“固體"組織之間不同的光散射特性。在放療后跟蹤檢測腫瘤脈管系統時，svOCT不需要造影劑，且掃描時間短（幾秒至幾分鐘，取決于腫瘤大小）、處理速度快、成像深度好（1-3mm，取決于組織和腫瘤類型）、不受血流或血管方向影響。另外OCT掃描儀現在相對便宜，又便攜。
本研究建立在十年背景工作的基礎上。最初Mariampillai等人開發了用于微血管監測的svOCT方法。Leung等人設計了加熱式動物固定器。Maeda等人優化了背部皮膚窗室（dorsal skin window chamber, DSWC）模型，并對單次30 Gy劑量放射療法的短期反應（2周）進行了初步研究。Conroy等人開發了利用生物計量學進行脈管系統量化的后處理技術。本研究在過去十年經驗的基礎上，從根本上改進和完善了成像和分析平臺的方方面面，使得它能夠識別血管放射生物學反應。
選擇NOD-Rag1nullIL2rγnull（NRG）小鼠品系進行本研究，它具有抗輻射和免疫缺陷的特性。使用Bx-PC3人胰腺癌細胞研究其對輻射的反應。選擇管體積密度（vascular volume density, VVD）作為微血管度量標準，因為它計算簡單（血管像素的數量除以選定體積中的總像素）、穩定性好、受操作員影響最小且結果復制方便。還進行了兩項與脈管系統無關的測量來跟蹤放療：每次svOCT成像后，用卡尺測量腫瘤體積并使用熒光顯微鏡測量腫瘤細胞的熒光強度。切除放療后的腫瘤，進行組織學染色和組織病理學評估，以支持和驗證體內縱向觀察結果。
圖1 （a）攜帶BX-PC3腫瘤的NRG小鼠。背部在DSWC安裝前被剃光。（b）DSWC安裝過程中生長的腫瘤。（c）安裝了DSWC的小鼠。（d）DSWC安裝后9周并放射治療后7.5周（單劑量20 Gy）的小鼠。（e）將NRG小鼠置于小動物輻照器中。225kVp x光從底部入射。（f）DSWC內的腫瘤圖像。（g）在10 Gy單劑量放療后，腫瘤顏色發生變化。
圖2 實驗時間進程。在Day-28，將腫瘤細胞注射到背部皮膚中。當腫瘤體積達到3-5 mm后植入DSWC。植入后約10天對腫瘤進行照射（Day 0，標記為“R"）。放射后，立即檢測90 min內的腫瘤脈管系統。在放射后的5至8周內，用卡尺測量（腫瘤體積）、svOCT成像（脈管系統）和表熒光顯微鏡成像（癌細胞熒光）重復監測腫瘤變化。選擇幾只動物在放療后進行腫瘤切除并進行組織學染色，以支持和驗證體內觀察結果。（b）腫瘤背面圖。（c）腫瘤正面圖。（d）svOCT微血管圖（c中黑色虛線框）。（e）腫瘤細胞Ds-Red熒光圖像。
圖3 swept-source OCT系統裝置示意圖。SOA：半導體光放大器；PC：偏振控制器；A：光纖衰減器；DB：雙平衡光電探測器；DAQ：數據采集卡；C：準直器；MZ干涉儀：馬赫-曾德爾干涉儀；L：透鏡；M：鏡子；SG：掃描振鏡；CR：環行器。
圖4 通過svOCT實時成像的腫瘤微脈管系統。（a）DSWC中的腫瘤組織。（b）6 × 6mm2視野的OCT體積式圖像。（c）同一位置的8次連續B-scan，用于svOCT分析所需的的frame間比較。（d）進行frame間像素紋理比較的算法。（e）使用svOCT算法獲得的SVzx血管橫截面。（f）血管en-face二維投影。（g）深度編碼的血管en-face二維投影。（h）b圖組織中深度編碼的血管。
結果
01-放射前腫瘤的脈管系統生長情況
如圖5所示，皮下注射腫瘤細胞后約2周內，腫瘤脈管系統侵襲性地活躍發展。注射后第3天，鄰近正常組織中出現微血管生長（圖5a），一周后形成爪狀（圖5b），約第10天形成連接（圖5c），隨后更多的新血管在腫瘤內迅速發芽，并在幾天內達到*的脈管化（圖5d）。腫瘤中血管床的結構與正常組織中的有明顯不同，正常組織中血管床結構分級更明確（圖5e），且血管分布更有序、更均勻，以使營養物和氧氣能充分灌注到所有細胞中。相反腫瘤血管不成熟、彎彎曲曲、直徑不規則、還經常有嚴重彎曲，形成一個沒有層次的混亂迷宮，無法清楚識別其中的小動脈、毛細血管和小靜脈。
圖5 皮下注射癌細胞后16天內BX-PC3胰腺腫瘤的脈管系統發育情況。（a）注射后3天；（b）7天；（c）10天；（d）16天。（e）用于比較的健康組織脈管系統。
02-放射治療后的腫瘤生長動力學變化
已知對人腫瘤異體移植模型進行單次高劑量照射會造成血管的快速改變。圖6中深度編碼的svOCT證實了10 Gy放射后微血管的這種即刻反應。放療半小時后，血管體積密度顯著降低了26%（圖6a, b）。小血管（直徑10-30 μm）反應最大，中小血管（直徑30-70 μm）受影響較小。
但多數血管密度改變似乎是非yongjiu性的。在放療后45 min和60 min都檢測到微循環恢復（圖6c，d），并且在90 min恢復到初始血管的90%（圖6e）。這可能是放射后暫時性微血管血栓形成或毛細血管與旁路合流造成的，換句話說，那些在放療后較晚時間點重新出現的血管并沒有因為放療而yongjiu受損。約10%的血管yongjiu消失，可能是由于放射誘導的內皮細胞死亡，以及血漿蛋白外滲引起的間質液壓力升高，導致脆弱的腫瘤血管塌陷。
圖6 單次10 Gy劑量放療后，1.5h內的腫瘤微血管應答。（a）放射前；（b）放射后30 min；（c）45 min；（d）60 min；（e）90 min。圖下方數字為放射后血管體積密度與放射前密度的比率。
圖7為6周內（放療前1周至放療后5周），單次20 Gy劑量放療對腫瘤微血管的影響。腫瘤*血管形成后進行放射（Day-0），放射后1.5 h觀察到初始反應（Day+0），血管密度為放射前的83%。放療后t = 2、6、8天與腫瘤邊緣的血管相比，腫瘤核心的血管更容易受到影響。這支持了以前的推測，即腫瘤周圍的部分血管網約等于正常血管，是由組織正常血管出芽繼續向腫瘤內發生形成的，與腫瘤核心區血管形成產生的新腫瘤血管相比，這些血管可能更耐輻射。
約10天以上的數據進一步證明，腫瘤會通過存活血管的生長來重新構建其脈管系統，這與早期的研究和假設一致，即局部照射后腫瘤的再生長依賴于存活下來的內皮細胞生成的血管。此外在10天以上的血管重建過程中，腫瘤區域似乎也變得越來越小。
圖7 腫瘤脈管系統對單次20 Gy劑量放射的應答。Day-0圖像在放療前1 h拍攝，Day+0為放療后1.5 h。對腫瘤脈管系統的最大抑制約在第8天。
除以上成果外，本研究中的svOCT平臺的真正價值在于其巨大的成像吞吐量能力和可量化度量的提取。因此，對整個動物研究（n=60）進行了定量總結，對應三個放射劑量水平（再加上未放射的對照），三個測量變量的應答情況：從svOCT圖像中提取的腫瘤VVD（圖8a）、通過卡尺測量獲得的腫瘤體積（圖8b）、通過顯微鏡獲得的熒光強度（圖8c）。
縱向監測了約10周，從中總結出幾個較為明顯的變化趨勢：
放射會抑制血管密度（可抑制達放射后2-4周）；
抑制程度隨劑量水平而增加（10 Gy后2周下降約10%，30 Gy后4周下降約70%）；這種減少是暫時的（因此單劑量不足以yongjiu控制腫瘤），最終血管密度恢復到放射前的水平；
血管密度恢復到放射前水平的時間隨劑量增加而增加（10 Gy約3.5周，30 Gy時8周以上）；
放射后1.5 h內，高放射劑量組中腫瘤微血管的應答更明顯（30 Gy后23%的微血管顯示暫時關閉，而10 Gy后為10%）。大多數為直徑小于30 μm的微血管；
對比接受放射的三組及未放射的對照組，計算組間是否確實有差異。對于t >1.5周，確定有差異，P值在0.0001-0.01范圍內。對于從照射剛剛結束到1-1.5周，情況不明確，P值在0.03-0.15范圍內（10 Gy到0 Gy組間最大P值出現在t < 1周時）。因此得出結論，微血管應答差異隨劑量的增加而增加，且需要約1-1.5周才能明確顯示出來。
腫瘤體積對不同劑量的應答變化（圖8b）也展示出復雜的動力學，其整體對劑量的依賴性與血管密度有些相似，時間反應總體上比微脈管系統慢。放射后4-5周腫瘤達zuidachegndu的收縮（最小腫瘤體積），與劑量水平無關。與VVD相似，腫瘤收縮程度的最大值隨劑量而增加（10 Gy為20%，30 Gy為80%），并且恢復到初始體積的時間也呈劑量依賴性（10 Gy為5.5周，20 Gy為8周，30 Gy為8周以上超出實驗觀察時間）。此外在照射后1.5-3周的早期生長抑制情況較復雜，早期無明顯收縮，隨后腫瘤體積迅速加速減少，在4-5周達最小，然后恢復。因此未來非常有必要在其他腫瘤模型中對此進行檢查驗證。
已知腫瘤DsRed熒光強度可代表癌細胞活力水平，并能用于間接測量腫瘤中低氧細胞比例。圖8c為三種劑量下該度量的應答曲線，同樣，曲線總體形狀與VVD和腫瘤體積曲線類似，顯著不同的是在放射后很早期熒光強度急劇下降。具體而言，放療后一天內，腫瘤細胞熒光強度顯著下降（10 Gy下降14%，20 Gy下降30%，30 Gy下降48%）。隨后1-2周略微增加，隨后是另一次下降（10 Gyzuidi點在3周達85%；20 Gy在4周達60%；30 Gy在5周達30%）。隨后的恢復時間也呈劑量依賴性：4周（10 Gy）、6.5周（20 Gy）和7.5周以上（30 Gy）。
圖8d為單次20 Gy劑量時，三個度量的應答變化情況，以更好地理解和解釋其間的關聯。放射后不久，腫瘤細胞熒光強度明顯下降，伴隨腫瘤毛細血管和小血管塌陷，隨后脈管系統在頭兩天內部分恢復。腫瘤細胞殺傷（直接細胞損傷和脈管誘導的細胞死亡結合）導致腫瘤生長停滯，腫瘤在最初的10天內尺寸逐漸減小。對于脈管誘導的細胞死亡機制，在20世紀80年代有人指出，一個內皮細胞可對應一塊含多達2000個腫瘤細胞的腫瘤部分，因此一個內皮元件的崩潰可能導致沿著失效血管的腫瘤細胞死亡雪崩。如結果所示，與腫瘤體積相比，VVD響應在時間和幅度上領xian。隨著腫瘤收縮VVD呈現平穩狀態，更多的癌細胞獲得氧氣和營養，這可能是腫瘤暫時復發（t~2周）的原因。盡管存在短暫的體積增加趨勢，但血管數量繼續減少，可能導致局部缺氧（腫瘤熒光曲線），并導致放療后第4周腫瘤顯著收縮至原始大小的45%。放療后約2周，通過存活血管的生長開始腫瘤再血管化。隨著血管開始再生長并從周圍組織萌出進入腫瘤（圖6，第13-35天），腫瘤熒光強度也開始增加（延遲幾天）。幾天后，腫瘤停止收縮，隨后在7.5周*再生。
圖8e為Kozin等人于2012年提出的放射生物學理論模型，基于迄今為止不同的（并且經常是相互矛盾的）放射的組織研究報告。盡管數據不是最佳的，但作者確實提出了單次高劑量放射后微血管動力學的所謂機制，包括腫瘤體積收縮和隨后再生長。理論上預測的腫瘤體積曲線的總體形狀與我們研究的實驗數據非常一致。
圖8 單次10、20和30 Gy劑量局部放射后，通過血管體積密度（VVD）、腫瘤體積和熒光強度的變化反映出的腫瘤發展動力學。（a）腫瘤微血管應答。（b）腫瘤體積應答。（c）腫瘤熒光應答。未受照射的腫瘤（0 Gy數據）因生長過大無法顯示所有數據。（d）20 Gy單劑量輻照的VVD、體積和熒光應答的總結圖表。（e）文獻提出的腫瘤生長和20 Gy單劑量照射后微血管相應變化的模型。
圖9為對照組和三個放射組（10、20和30 Gy）腫瘤區域的H&E染色和TUNEL染色。腫瘤細胞在放射前處于活躍增殖狀態（TUNEL），有許多中小血管（H&E）（圖9a）。10 Gy放射后兩周（圖9b），主要是基質細胞受到影響，16%的癌細胞發生凋亡（TUNEL）。20 Gy放射后2周（圖9c），癌癥和基質細胞中度損傷（48%）。30 Gy放療后2周（圖9d），腫瘤核心基質細胞和癌細胞幾乎*損傷（98%）（TUNEL）。與腫瘤體內動力學相似，這些組織學結果進一步強調了劑量水平和放療后經過的時間在腫瘤放射生物學反應的復雜軌跡中的重要性。
圖9 H&E（上排）和TUNEL（下排）染色圖片。（a） 0 Gy放射；（b）10Gy；（c）20Gy；（d）30Gy。放療后2周切除腫瘤。整個腫瘤切片中TUNEL陽性率分別為0.3%、15.8%、47.6%和97.7%。
結論
本研究展示了體內異種移植人胰腺腫瘤對三種不同放射劑量水平的應答結果，在放射后進行了長達8周的無創成像。開發、完善并驗證了一種專門用于該研究的功能性OCT微血管成像和量化平臺。通過該平臺收集了體內測量數據，包括腫瘤大小和熒光，以補充獲得的微血管信息，并與已有的放射生物學模型進行了比較。作為度量標準，血管體積密度易于計算，且結果可靠，適合用于反映腫瘤微血管對輻射的應答。這些成果非常有參考價值，未來我們需要檢查它在其他臨床前體內模型中的可推廣性，探索分級（多劑量治療）的效果，并進一步將基于OCT的放射治療監測平臺擴展臨床試驗研究中，實現對患者進行微血管放射治療監測。
參考文獻：
Demidov, Valentin , et al. "Preclinical longitudinal imaging of tumor microvascular radiobiological response with functional optical coherence tomography." Scientific Reports 8.1(2018):38.