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血管造影OCT能夠區分小鼠皮下表達不同VEGF亞基的纖維肉瘤的血管模式
小鼠皮下植入腫瘤模型常用于癌癥研究，盡管腫瘤植入的位置很淺，但對于微血管研究來說，以足夠的空間分辨率進行無創成像仍然是一個難題。英國謝菲爾德大學的研究人員Robert A. Byers等評估了使用OCT血管造影術直接對這種小鼠模型中腫瘤血管成像的能力。使用的腫瘤來源于纖維肉瘤細胞，經基因工程改造后僅表達VEGF120或VEGF188（分別為fs120和fs188腫瘤）。研究發現fs120腫瘤的血管直徑（60.7 ± 4.9 μm）顯著大于fs188腫瘤（45.0 ± 4.0 μm）。fs120腫瘤還顯示出明顯更高的血管彎曲度、分形維數和密度。為觀察皮下腫瘤微循環的縱向動力學提供了一種可靠、無創的方法。研究成果以“Vascular patterning of subcutaneous mouse fibrosarcomas expressingindividual VEGF isoforms can be differentiated using angiographic opticalcoherence tomography"為題發表于Biomedical Optics EXPRESS。
背景
生物體中，主要動脈和靜脈的結構特征受遺傳控制，通常在個體間保持一致。然而微血管系統則會受到局部微環境中分子和機械刺激而發生動態重塑。腫瘤的生長依賴于持續的微血管化過程，特別是通過血管生成，這也促進了腫瘤的轉移，由此產生的腫瘤脈管系統在形態和功能上都是異常的，研究腫瘤的脈管系統可能為腫瘤的發展和病理生理學提供很有價值的信息。
利用小鼠癌癥模型進行的血管造影成像研究在腫瘤學研究中特別重要，能大大有助于我們了解腫瘤的生長、進展和活體動物的治療。而傳統的尸檢方法如免疫組織化學，仍在量化植入腫瘤內的微循環中占重要地位。非侵入性成像技術由于縱向血管可視化的潛力很快獲得了發展，大大減少了產生統計可靠數據所需的動物數量。目前，活體顯微技術被廣泛用于研究腫瘤生長，通常包括用透明玻璃蓋玻片對高度散射的皮膚層進行手術置換。使用該模型，血管造影OCT成像已被用于實現腫瘤動力學和治療反應的高分辨率縱向成像。此外，通過灌注計算機斷層掃描和動態磁共振成像，已經實現對皮下生長腫瘤的體內全視野血管造影，同時覆蓋的皮膚完好無損。最近，多光譜光聲斷層掃描已被用于可視化1 cm3腫瘤體積中的血管形態和氧合，分辨率達70 μm。
盡管取得了這些進展，但對皮下植入腫瘤內的微循環（通常直徑為5-50 μm）進行非侵入性成像仍然具有難度，因為成像所用的光學模式通常無法穿透皮膚的高度散射層。OCT已被廣泛用于捕捉人體皮膚內的結構和血管造影圖像。zuizhide注意的是，OCT在組織內的穿透深度可達約1 mm，并能夠提取深度編碼數據，從而可以以高分辨率可視化組織的各個層。相比于幾毫米厚的人皮膚，雌性CD-1裸鼠淺表組織通常約550 μm厚（~30 μm表皮，~220 μm真皮，~300 μm皮下），因此皮下植入腫瘤的表面脈管系統是可見的，并且在OCT的視野內。散斑方差OCT（svOCT）可用于從四維OCT數據集（X-Y-Z-Time）中提取流動信息，在每個空間位置收集多個數據點。這是基于這樣一個事實，即與固體組織像素相比，流體像素將在OCT信號（散斑模式）中顯示快速演變的時間變化。因此，通過計算同一空間位置像素的方差作為時間的函數，在靜止固體和運動液體之間產生對比度。
本研究旨在開發和評估血管造影svOCT在小鼠皮下腫瘤成像中的應用及性能。試圖區分小鼠腫瘤內的血管形態，這些腫瘤來源于基因工程化的纖維肉瘤細胞，僅表達血管內皮生長因子的單一剪接變異體亞型；VEGF120或VEGF188（分別為fs120和fs188腫瘤）。以前，使用在植入小鼠背部的透明小室中生長的腫瘤和常規活體光學顯微鏡，我們觀察到與fs188腫瘤相比，fs120腫瘤血管更大、更雜亂，并形成更曲折的血管網絡。這項研究旨在確定這些不同的血管模式在皮下生長腫瘤的微循環中是否也存在，是否存在普遍性，并不僅限于褶皺窗室模型中。
圖1. 實驗裝置。A）用于異氟醚氣體麻醉給藥的嚙齒類動物面罩。B） CD-1裸鼠。C）塑料支架，輕輕接觸皮下腫瘤周圍的皮膚。D）OCT成像探頭（Vivosight）。E）反饋控制的加熱墊。F）直腸溫度探頭（反饋至加熱墊）。G）用于OCT成像探頭重新定位的移動夾具。
結果
01-表達VEGF120和188的腫瘤的目視檢查
圖4為CD1裸鼠對照皮膚和皮下植入腫瘤皮膚的en-face svOCT圖像，帶有深度編碼信息。使用svOCT時大的異常血管網在只能在植入后約8-15天可見（圖4E-L），在此之前可見的是更規則的有組織的血管網絡（圖4A-D）。表明腫瘤血管發育的早期階段，血管處在組織更深層，無法通過OCT成像。然而腫瘤充分擴張后，通常在植入后約10天，OCT系統視野內可以清楚地看到大的異常血管。后期掃描中除了較大的異常血管外，0-400 μm處的血管造影信號相對較低，意味著似乎沒有觀察到類似基線脈管系統的結構，表明隨著皮膚在腫瘤表面上伸展，正常血管中的血流停止。此外，fs120腫瘤似乎比fs188更具浸潤性，血管大部分呈紅色（0-400 μm深度），而fs188大部分血管呈綠色（400-800 μm）。這可能與細胞的*表型有關，無論是體外或體內研究中，fs120細胞都比fs188表現出更強的增殖表型。本研究中svOCT技術有一個局限性，在檢測到的血管下觀察到陰影效應，這是由血液對光子的前向散射引起的,會遮擋下面的脈管系統。就fs120腫瘤而言，許多可能位于400-800 μm深度（綠色）的血管被0-400 μm深度（紅色）的淺表血管遮擋住了，這使得在同等深度進行血管密度計算具有一定難度。
圖4. en-face svOCT圖像。A-D）無腫瘤的基線鼠皮膚脈管系統。E-L）已建立的皮下腫瘤脈管系統。E-H）fs120腫瘤。I-L）fs188腫瘤。所有圖像都是從不同的動物身上拍攝的。顏色對應被檢測血管的深度，紅色在皮膚表面下0-400 μm，綠色在皮膚表面下400-800 μm。
02-縱向腫瘤監測的評估
無創皮下腫瘤成像的一個關鍵優勢是能對腫瘤生長和血管發育進行縱向觀察。圖5為縱向數據采集舉例，在5天的時間內分別采集同一個fs120和fs188腫瘤的圖像。對fs188腫瘤內血管發育進行了從第0天到第15天的長時間可視化。
圖5 頂行和中間行為5天內對fs120和fs188腫瘤的svOCT短期監測圖。圖像經UnwarpJ 彈性配準過，使得相同的血管在后續frame中對齊。底行為從腫瘤植入前到腫瘤植入后15天對fs188腫瘤的長期縱向血管進展監測圖。
fs120腫瘤中，每平方毫米的平均血管長度在植入后第14天達到最高（4.1 mm-1），然后第15天降至1.4 mm-1，第17天恢復至3.5 mm-1，隨后第18天再次降至2.1 mm-1。相比之下fs188腫瘤中，平均血管長度從第14天的1.1 mm-1增加到第15天的2.2 mm-1，第17天減少到2.0 mm-1，隨后第18天恢復到2.2 mm-1。計算植入后14至18天內，兩組腫瘤中每平方毫米平均血管長度的標準差，用t檢驗評估顯著性。除去不合適的數據，最終可行數據集的數量n = 4。雖然與fs188組（SD = 0.4 mm-1）相比，fs120組的血管長度隨時間的變化更大（SD = 1.4 mm-1），但由于樣本數量少，該結果在統計學上并不顯著（p = 0.063）。因此尚不能確定fs120腫瘤平均血管長度是否確實是每天變化較大。圖6為每只動物每平方毫米平均血管長度隨時間的變化。
圖6 皮下腫瘤內每平方毫米血管長度隨時間變化的線圖，藍色為fs120，紅色為fs188。
血管數量每天的變化不太可能是血管重塑造成的，可能是塑料支撐帽對皮膚產生的壓力，或者血管連接內的局部血流減少到OCT系統的幀采集間隔（~ 30ms）以下，血流信號喪失。此外當該區域對溫度等外部刺激的微小變化做出穩態反應時，也可能會引發血管收縮或上游血管分流導致血管不可見。本研究使用的異氟醚麻醉劑也很可能既影響體溫調節抑制的程度，又作為心血管抑制劑，降低血壓。
03-OCT深度穿透評估
圖7為從CD1裸鼠背部采集的OCT B-scan與組織學樣本的比較。健康皮膚（圖7A，B）中，厚厚的皮下層（約400 μm）填充有密集的毛囊，毛囊會散射入射的1300 nm OCT光束，阻止光穿透到組織深處。OCT圖像的右側可以看到一部分薄薄的橫紋肌層，但這層下的結構看不到。
圖7. 比較OCT與組織切片的穿透深度。A）健康皮膚的H&E染色切片。B）健康皮膚的OCT（與A的動物不同）。C）fs120腫瘤上方皮膚的H&E染色切片，顯示缺乏肌肉層。D）fs120腫瘤上方皮膚的OCT B-scan（與C同一只動物）。E）fs188腫瘤上方皮膚的H&E染色切片，可見肌肉層下方的fs188腫瘤。F）fs188腫瘤上方皮膚的OCT B-scan（與E同一只動物）。
已知鼠皮膚內皮下組織的厚度受毛發周期調節，但腫瘤的存在明顯改變了外部皮膚形態（圖7C，E）。考慮到皮下組織在橫截面OCT圖像上的對比度變化，選擇組織切片進行皮下組織厚度的測量研究。使用MATLAB手動跟蹤皮下組織的上層和下層，然后結合上下層邊界之間的垂直距離來計算皮下組織厚度的平均值。對比健康皮膚（n = 7）與研究結束時fs188和fs120腫瘤（每組n = 7）周圍皮膚中的皮下組織厚度，在三組間進行單因素方差分析，HSD檢驗以評估顯著性，結果總結在圖8中。
圖8. 健康皮膚的皮下組織層厚度變化，與包裹著直徑約12 mm的fs188和fs120腫瘤的皮膚皮下組織層厚度變化的比較。
健康皮膚的皮下組織（357 ± 94 μm）明顯比fs188組（182 ± 62 μm，p<0.01）和fs120組（57 ± 60 μm，p<0.001）的皮下組織厚。fs188和fs120組中皮膚的厚度顯著減少（p = 0.015）可能是由皮膚在生長的腫瘤上伸展時受到異常應力引起的。fs188腫瘤中可觀察到皮下組織變薄（圖7E，F），OCT能夠捕獲皮膚的上層（表皮、真皮）、脂肪層（皮下組織）、肌肉層及腫瘤內約500 μm深處，總穿透深度約1 mm。在fs120腫瘤組中，大多數皮膚形態比較特殊，因為缺乏橫紋肌層，在一些jiduan情況下皮下組織也受到嚴重破壞，脂肪細胞分散在腫瘤內，皮下組織中也明顯缺乏毛囊（圖7C），再次證明fs120腫瘤可能更具侵襲性。在fs120這種情況下，淺表皮膚的剩余層厚約200 μm，僅由表皮、真皮和極薄的皮下組織構成，因此OCT能觀察腫瘤組織更深處（圖7D），這可能解釋了為什么在小于300 μm的表面深度處可以看到大的異常腫瘤脈管系統（圖4）。
圖9為健康、fs120和fs188皮膚的H&E和CD31染色切片之間的比較。健康皮膚中（圖9A、D、G），CD31免疫染色顯示小鼠皮膚的整個真皮、皮下組織和橫紋肌層中存在血管內皮細胞。紅色箭頭所示為最大的可見血管腔，直徑約15 μm。在含fs120腫瘤的皮膚中（圖9B、E、H），腫瘤周邊大部分血管都可見，最大的直徑約65 μm（紅色箭頭）。在含fs188腫瘤的皮膚中（圖9C、F、I），真皮/皮下組織內仍有血管形成的證據，但是大多數可見血管位于腫瘤內部，位于深度約為600 μm的橫紋肌層正下方，最大直徑約50 μm（紅色箭頭）。
圖9. A-C）健康、fs120和fs188皮膚的H&E染色切片。D-F）健康、fs120和fs188皮膚的CD31免疫染色切片。內皮細胞被染成棕色。紅色箭頭為最大的可見血管腔。G-I）紅色方框中的放大圖。此處的fs120腫瘤是植入后14天切除的，與圖9中的腫瘤不同；fs188腫瘤是在植入后20天切除的，與圖9中的為同一個腫瘤。
一般來說，該系統的穿透深度足以捕獲fs120和fs188腫瘤內的淺層脈管系統，但在某些特定位置，軸向深度穿透仍取決于上皮層中是否存在高散射結構。圖7B、D、F中可見表面散射結構（如毛囊）的帶狀陰影，這些陰影可能會遮擋正下方血管的血管造影信號。
04-定量血管度量
血管造影圖像二值化產生血管骨架，從而定量血管參數。結果發現，fs120腫瘤（60.7 ± 4.9 μm）的平均血管直徑明顯高于fs188腫瘤（45.0 ± 4.0 μm），與之前使用窗室模型的活體觀察研究結果一致。Vakoc等人已經證明了窗室模型成像的背景下對于大血管，多光子顯微術和OCT血管造影之間具有良好相關性，但對直徑小于12 μm的毛細管相關性較差。考慮到fs188腫瘤血管形態較薄，對fs188平均血管直徑測量的影響可能比對fs120更大，但不同腫瘤類型之間的差異仍然顯著。
圖10. fs120腫瘤（n = 9）和fs188腫瘤（n = 8）間定量血管參數的變化。
fs120腫瘤每平方毫米的總血管長度（4.3 ± 1.5 mm-1）明顯大于fs188（2.2 ± 0.7 mm-1），fs120腫瘤的總血管密度（31.7 ± 11.1%）也比fs188腫瘤（14.8 ± 5.0%）高，與之前研究得到的密度計算值一致。而之前的窗室模型中得到的結果與此相反，fs120腫瘤每平方毫米總血管長度較低。這很可能是不同深度或量化方法造成的。事實上由于fs188腫瘤浸潤性較弱，脈管系統處于較表層皮膚中，而本所用文骨架化是在0-800 μm的大深度范圍內進行的，這將直接導致檢測到的整個fs188脈管系統的長度減少。但相同組織深度直接比較，fs120中深處血管又會被淺表血管的陰影所遮擋，產生不準確結果。因此本研究只考慮qian100 μm的可見脈管系統，將脈管系統與組織深度分離，得出的fs120腫瘤每平方毫米血管長度（1.5 ± 0.7 mm-1）顯著低于（p = 0.04）fs188腫瘤（2.2 ± 0.3 mm-1）。仍不能確認諸如總血管長度/密度之類的深度相關度量是否可靠。
不同腫瘤類型之間平均血管段長度沒有顯著差異，與之前的窗室模型觀察結果一致。fs120組中的血管網絡的平均彎曲度和分形維數（分別為1.56 ± 0.29和1.33 ± 0.17）都顯著高于fs188組（分別為1.33 ± 0.13和0.98 ± 0.18）。考慮到不同腫瘤類型之間的平均血管段長度沒有差異，fs120腫瘤中彎曲度較高意味著fs120血管網絡的分支點比fs188腫瘤的分支點靠得更近，而不是分支點之間的血管本身更彎曲。這反映在分形維數測量中，fs188s的分形維數較低，表明血管網絡更規則、更有組織。這也與之前用活體顯微鏡對這些腫瘤類型的觀察相一致，即fs120血管通常較寬且排列非常混亂，而fs188血管規則排列且均勻狹窄。
總結
本文使用OCT系統成功地非侵入性地量化了皮下植入的表達不同血管內皮生長因子亞型的小鼠腫瘤的淺表脈管系統的形態學差異，獲得的結果與先前研究中常規方法結果一致。證明使用OCT無需手術干預即可測得腫瘤血管的已知形態學差異，不但允許對腫瘤進行三維環境中的生長和觀察，還可實現縱向監測。為腫瘤研究提供了新思路，也為臨床治療護理提供了非常有價值的工具。
參考文獻：Robert, et al. "Vascular patterning of subcutaneous mouse fibrosarcomas expressing individual VEGF isoforms can be differentiated using angiographic optical coherence tomography." Biomedical Optics Express (2017).