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使用高光譜受激拉曼散射在乳腺活檢中基于鈣化評估腫瘤惡性程度
基于組織鈣化可對乳腺腫瘤惡性程度進行精確評估，這對疾病診斷及了解腫瘤發(fā)展過程非常關(guān)鍵。傳統(tǒng)的X光鉬靶可提供鈣化的整體形態(tài)但缺乏化學(xué)信息。自發(fā)拉曼光譜可提供詳細的化學(xué)數(shù)據(jù)但缺乏空間分布信息。復(fù)旦大學(xué)研究人員Yifan Yang等基于光譜和空間域分析，應(yīng)用高光譜受激拉曼散射（SRS）顯微術(shù)來提取微鈣化的化學(xué)和形態(tài)特征。成像了23例患者的共211個鈣化點，并用基于支持向量機（SVM）的分類算法對結(jié)果進行了分析。通過優(yōu)化微鈣化的化學(xué)及幾何特征組合，使良性和惡性病例的區(qū)分精度能達到98.21%，召回率100.00%，相較基于純光譜學(xué)或成像的方法有顯著改善，可實現(xiàn)新鮮組織的快速準確評估。文章以“Microcalcification-Based Tumor Malignancy Evaluation in Fresh BreastBiopsies with Hyperspectral Stimulated Raman Scattering"為題發(fā)表于Analytical Chemistry。
背景
乳腺癌是女性癌癥相關(guān)死亡的第二大原因，每年占所有癌癥病例的23%。惡性腫瘤的早期和準確診斷可極大幫助降低發(fā)病率和死亡率，減輕患者經(jīng)濟負擔(dān)。目前早期檢測的主要篩查工具是X光鉬靶（X-ray mammography），其中鈣化被認為是了解和評估疾病的重要特征。這些鈣沉積物中包含豐富的化學(xué)成分混合物（如磷酸鹽、草酸鹽和碳酸鹽），以及與腫瘤發(fā)展和惡性腫瘤密切相關(guān)的各種形態(tài)信息（大小、形狀和分布）。然而X光鉬靶僅能提供鈣化的形態(tài)學(xué)特征而沒有化學(xué)成分信息，并不足以精確評估腫瘤狀態(tài)。因此結(jié)合乳腺鈣化的化學(xué)和組織學(xué)特征的方法對于提高診斷準確性至關(guān)重要。
基于分子鍵振動的指紋光譜特征的拉曼光譜可提供zhuoyue的化學(xué)識別能力。與用于表征乳房鈣化的其他光學(xué)方法相比，拉曼散射的特點在于揭示內(nèi)在的組織和生物礦物的化學(xué)成分。已經(jīng)證明根據(jù)草酸鈣（CAO）、羥基磷灰石（Hap）和碳酸鹽的光譜特征，拉曼光譜可區(qū)分不同類型乳房鈣化。已知I型鈣化是透明的，由CAO晶體組成，這種鈣化只發(fā)現(xiàn)于良性導(dǎo)管囊腫中，癌中很少發(fā)現(xiàn)；而II型鈣化是不透明的，主要由鈣Hap組成，鈣Hap存在于良性和惡性疾病中，但Hap中碳酸鹽的豐度顯示與惡性腫瘤呈負相關(guān)。此外鈣化中的蛋白質(zhì)水平也與惡性腫瘤相關(guān)。但自發(fā)拉曼散射截面成像速度過慢（約每幀一小時），不能提供足夠的被認為與疾病狀態(tài)相關(guān)的形態(tài)學(xué)信息。如根據(jù)乳腺成像報告和數(shù)據(jù)系統(tǒng)（BI-RADS），放射技師會將“爆米花樣"鈣化物歸入低風(fēng)險類別。沒有空間分辨率的情況下，自發(fā)拉曼光譜僅能提供關(guān)于異質(zhì)鈣化復(fù)合體的空間平均化學(xué)信息。
為將光譜和空間域信息連接起來，研究人員應(yīng)用高光譜受激拉曼散射（hyperspectral stimulated Raman scattering, SRS）顯微術(shù)來研究微鈣化。作為一種新的化學(xué)成像方式，SRS信號強度和成像速度提高了幾個數(shù)量級，同時保持了化學(xué)分析的不失真譜線形狀。與傳統(tǒng)自發(fā)拉曼散射不同，當(dāng)泵浦（ωp）和斯托克斯脈沖（ωs）同時與鍵振動（頻率Ω）相互作用時，SRS從受激發(fā)射過程中得到增益，鍵振動與兩個激光束之間的拍頻共振（Ω = ωp - ωs）。SRS在各研究領(lǐng)域顯示出廣泛的應(yīng)用潛力，特別是生物和生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，包括腫瘤的無標記診斷、化學(xué)分析、細胞代謝、藥物輸送、生物燃料等。當(dāng)進一步與機器學(xué)習(xí)算法結(jié)合時，SRS在自動與智能診斷的快速無標記組織學(xué)應(yīng)用方面顯示出巨大成功。雖然已有研究嘗試過用SRS光譜分析在薄組織切片中評估乳房鈣化，但還沒有過將化學(xué)和組織病理學(xué)信息集成到一起用在腫瘤評估中。另外新鮮組織活檢更適合形態(tài)學(xué)成像和特征提取，沒有通常在冷凍組織切片中出現(xiàn)的切片及冷凍偽影。因此對新鮮組織中的微鈣化進行高光譜SRS成像，將為乳腺腫瘤的惡性程度評估提供新思路。
本文使用高光譜SRS評估良性和惡性乳腺病變的各種微鈣化中，腫瘤惡性和多維SRS特征之間的相關(guān)性。從新鮮人乳腺活檢樣品中獲取鈣化的指紋SRS光譜（900-1100cm-1）和化學(xué)選擇性圖像。使用光譜分析提取檢測窗口內(nèi)的主要化學(xué)成分（Hap、碳酸鹽和蛋白質(zhì)），處理圖像以提取每個鈣化點的主要形態(tài)特征（幾何和紋理）。最后，利用支持向量機（SVM）對乳腺病變進行分類，通過組合并優(yōu)化化學(xué)和形態(tài)學(xué)特征，使分類精度得到顯著提高。
結(jié)果
01-新鮮乳腺活檢的SRS成像
全乳X光鉬靶成像后，顯示出了分散鈣化（圖1A左），芯針抽吸可能包含豐富鈣化的病變進行組織活檢。在SRS顯微鏡下，可對不同化學(xué)成分進行選擇性成像以揭示其空間分布。在高頻C-H拉伸區(qū)可以看到整個組織的組織病理學(xué)（圖1A右），拉曼頻率2845cm-1（CH2拉伸）和2930cm-1（CH3拉伸）處可見脂質(zhì)（綠色）和蛋白質(zhì)（藍色）分布，而在指紋頻率區(qū)，962cm-1（白色）處可檢測到乳腺組織內(nèi)鈣化物（Hap）的分布。同時采用SHG通道對膠原纖維成像（紅色）。放大的微鈣化部位、細胞區(qū)域和結(jié)締膠原纖維等細節(jié)處可很容易地觀察到乳房組織內(nèi)的強烈不均勻性（圖1B）。
圖1 乳腺活檢的典型高光譜SRS成像結(jié)果。（A）從X光鉬靶區(qū)域獲取的活檢樣本多色SRS圖像。（B）圖A三處放大，顯示有鈣化、密集細胞和富含脂質(zhì)（綠色）、蛋白質(zhì)（藍色）、膠原纖維（紅色）和Hap（白色）的結(jié)締組織區(qū)域。（C）乳腺組織、標準BSA和Hap中微鈣化的SRS光譜。
除每個特定化學(xué)圖像中顯示的空間信息之外，超光譜SRS還可提供任何給定感興趣空間區(qū)域的光譜信息。圖1C為具有四個主要拉曼活性峰的鈣化的典型SRS光譜。通過比較純Hap和BSA的SRS光譜，可確定鈣化主要由Hap組成（962cm-1處有代表性的磷脂振動模式），并混合有一定量的蛋白質(zhì)（1005 cm-1和1032cm-1處的特征苯丙氨酸環(huán)呼吸振動模式）。約1072cm-1處的峰可歸因于磷灰石復(fù)合物中嵌入的碳酸鹽（CO32-）的υ1振動模式，與先前的研究一致。已知碳酸鹽取代會影響Hap的拉曼光譜，并且良性和惡性乳腺組織微鈣化物中的碳酸鹽豐度存在差異。這些微鈣化的光譜特征為基于SRS光譜的化學(xué)成分分析奠定了基礎(chǔ)。因為Ⅰ型鈣化僅存在于良性病例中，且檢測頻率窗口（900-1100cm-1）中沒有出現(xiàn)草酸鈣，所以本研究中僅關(guān)注Ⅱ型鈣化的診斷價值。
為收集和分析大量的微鈣化點，首先需要在新鮮活檢組織中有效地搜索它們。利用單通道SRS以962cm-1成像快速定位富含Hap的鈣化點，圖2展示了良性和惡性組織中嵌入的微鈣化圖像，同時還有脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和膠原纖維的化學(xué)圖像用以說明整個組織結(jié)構(gòu)。這些圖像可能已經(jīng)顯示出明顯的形態(tài)差異，良性鈣化顯得更密集和聚集，而惡性鈣化則顯得更分散，有大量更小的微結(jié)構(gòu)（毛玻璃樣）。在900-1100cm-1光譜范圍內(nèi)逐一對這些鈣化點進行高光譜SRS掃描。在所有23例患者中，共研究了211個鈣化點（101個良性，110個惡性），含用于定量分析的光譜和形態(tài)學(xué)信息。
圖2 帶有微鈣化的乳腺組織的典型SRS圖像。A、B為惡性組織，C、D為良性組織。綠色，脂質(zhì)；藍色，蛋白質(zhì)；紅色，膠原纖維；白色，Hap。
02-微鈣化點的光譜和形態(tài)特征提取
首先根據(jù)鈣化的SRS光譜分析了其中的化學(xué)成分。圖3A為標準BSA、Hap、裸組織以及良性和惡性鈣化的自發(fā)拉曼光譜，用以確認峰值分配。良性和惡性鈣化的SRS光譜如圖3B和C。可見每個光譜由四個窄拉曼峰組成，Hap（962cm-1）、Phe 1（1005cm-1）、Phe 2（1032cm-1）和CO32-（1072cm-1），位于寬XPM背景光譜之上。擬合所有上述峰，并提取與腫瘤惡性相關(guān)的三種主要化學(xué)物質(zhì)Hap、蛋白質(zhì)和碳酸鈣的相對豐度。如良性和惡性病例間，蛋白質(zhì)與Hap（Phe1/Hap）的比率、碳酸鹽與蛋白質(zhì)（CO32-/Phe 1）的比率有顯著差異（圖3B和C）。良性鈣化中的碳酸鹽含量往往較高，而惡性鈣化中總蛋白質(zhì)水平似乎更豐富。
圖3 鈣化乳腺組織的自發(fā)和受激拉曼光譜分析。（A）標準BSA、Hap、裸組織和良性及惡性乳腺組織鈣化的自發(fā)拉曼光譜。（B，C）良性和惡性鈣化的SRS光譜，擬合峰值代表Hap、Phe1、Phe2、CO32和XPM背景。
基于Hap的SRS圖像定量表征了Ⅱ型鈣化的形態(tài)學(xué)特征。良性（圖4A）和惡性（圖4B）鈣化的典型強度圖進一步轉(zhuǎn)換為二值圖像，以提取zuixiangguan的幾何特征，包括圓形度、面積、周長和傅立葉描述子。統(tǒng)計結(jié)果表明這些特征在良性和惡性病例間表現(xiàn)出顯著差異（圖4C和D）。例如，良性鈣化傾向于表現(xiàn)出面積更大、表面更光滑、圓形度更高和傅立葉描述子，與SRS圖像中直接觀察到的一致。X光鉬靶顯示在大鈣化中有類似的特征，但很難觀察到微鈣化。此外紋理特征也可以從原始強度圖像中提取（無需二進制轉(zhuǎn)換），但診斷價值并不高。
圖4 從鈣化的SRS圖像中提取形態(tài)學(xué)特征。（A，B）良性和惡性鈣化結(jié)果二值化的 SRS圖像。（C，D）所有測量乳房鈣化中提取的兩種形態(tài)特征的統(tǒng)計分布的箱線圖。
03-功能排序和選擇
從SRS光譜圖像中提取鈣化點的所有特征后，包括化學(xué)和形態(tài)學(xué)特征。Table 1列出了所有18個特征（2個光譜、8個幾何和8個紋理）。其中一些特征的區(qū)分性較高，如平均面積和化學(xué)比率。因此需要選擇信息量最大的特征，減少冗余信息，實現(xiàn)最佳計算效率。
應(yīng)用RFE算法對這些特征進行排序，如Table 1最后一列所示。似乎幾何特征總體上paimingzui高，而紋理特征排名較低。為找出區(qū)分乳腺惡行腫瘤的最佳特征組合，測試了五組特征進行訓(xùn)練與驗證，即2F、6F、8F、10F和18F。2F代表兩種化學(xué)/光譜特征。6F代表純幾何特征，包括paimingqian五的特征。8F包含光譜和幾何特征，均在前八排名內(nèi)。10F開始包含紋理特征。18F包含所有特征。旨在尋找產(chǎn)生最佳評估結(jié)果的特征組合。
04-基于機器學(xué)習(xí)的微鈣化點SRS評價
在上述特征組合選擇的基礎(chǔ)上，應(yīng)用SVM對所有實驗數(shù)據(jù)進行訓(xùn)練與驗證，以醫(yī)院的診斷結(jié)果作為基本事實。訓(xùn)練與驗證數(shù)據(jù)集以兩種方式進行比較：基于鈣化和基于患者。使用了不同的驗證方法：LOONCV和10倍嵌套交叉驗證，并根據(jù)準確性、精確度、召回率和F評分生成結(jié)果。
訓(xùn)練和驗證結(jié)果如圖5。總體而言，基于患者的數(shù)據(jù)集結(jié)果比基于鈣化的數(shù)據(jù)集結(jié)果更差，表明后者中存在過度擬合，因為同一患者的鈣化數(shù)據(jù)在訓(xùn)練集及驗證集之間交叉；因此基于病人的方法更適合。此外LOONCV性能最好，訓(xùn)練集比10倍方法更大，這特別適合于小規(guī)模數(shù)據(jù)集。此外SVM訓(xùn)練包含更多的特征并不一定會產(chǎn)生更高的評估精度。雖然從2F到8F的驗證結(jié)果越來越好，但當(dāng)特征數(shù)進一步增加到10F和18F時，驗證結(jié)果通常會下降。詳細觀察表明，純化學(xué)特征（2F）預(yù)測結(jié)果適中（準確率82.94%；精度85.58%），而純幾何特征（6F）效果更好（準確率95.26%；精度92.37%），二者的組合（8F）結(jié)果最好（準確率99.05%；精度98.21%）（圖5A和B）。圖5C和D顯示了基于鈣化和基于患者的LOONCV結(jié)果的ROC曲線，證明當(dāng)包含化學(xué)和幾何特征時該SVM模型的評估性能近乎wanmei。
圖5 不同特征組合的SVM模型評價結(jié)果。（A）基于鈣化和（B）基于患者的訓(xùn)練和驗證結(jié)果，包括純化學(xué)、純形態(tài)學(xué)、10倍和LOONCV的組合特征。每個雷達圖有八個軸：精度、召回率、精確度和訓(xùn)練與驗證結(jié)果的F分數(shù)。誤差線以相應(yīng)的顏色顯示。（C）基于鈣化和（D）基于患者的SVM模型的ROC曲線。
純形態(tài)特征和組合組的曲線下面積（AUC）值都達到了同樣的好結(jié)果，接近理想值1，這主要是因為它們近100%的高召回率（靈敏度）。意味著兩種模型產(chǎn)生的假陰性事件可以忽略不計。但完整的驗證結(jié)果可更全面地評估這些模型，表明組合特征確實表現(xiàn)最好，尤其是在精度和準確度方面（圖5A和B）。而包含紋理特征并不能幫助改善驗證結(jié)果，可能表明鈣化的紋理與疾病狀態(tài)的相關(guān)性要小得多。
結(jié)論
本研究發(fā)現(xiàn)，整合鈣化的化學(xué)和形態(tài)學(xué)信息可顯著提高乳腺腫瘤惡性評價效果，這也表明微鈣化的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)特征是相互關(guān)聯(lián)的。鈣沉積的形成過程與鈣化復(fù)合體的具體組成有關(guān)，進一步由不同疾病狀態(tài)的潛在生化性質(zhì)確定。SRS高光譜成像提取的特征包含有關(guān)鈣化的多維信息，可能會幫助對疾病進行準確分類。未來可側(cè)重于將這些SRS特征以較大規(guī)模數(shù)據(jù)集與不同類型和級別的乳腺腫瘤相關(guān)聯(lián)，以及開發(fā)相應(yīng)的機器學(xué)習(xí)算法。
利用新鮮的活檢樣本快速評估腫瘤惡性程度對術(shù)中診斷有重要實用價值。傳統(tǒng)的組織病理受限于耗時的組織制備程序。SRS無需處理樣本即可提供天然組織的內(nèi)在分子對比和組織結(jié)構(gòu)，以無標記的方式高速得到化學(xué)和形態(tài)學(xué)信息。光學(xué)技術(shù)和深度學(xué)習(xí)算法也不斷推進著超光譜SRS顯微術(shù)的發(fā)展，這對腫瘤評估中微鈣化的快速分析大有裨益。另外手持式SRS檢測和小型化設(shè)備提高了實用性，使該技術(shù)有望向臨床轉(zhuǎn)化。
參考文獻：Yifan Yang, Yinlong Yang, etal. Microcalcification Based Tumor Malignancy Evaluation in Fresh Breast Biopsies with Hyperspectral Stimulated Raman Scattering. Analytical Chemistry. 2021,93,15,6223-6231.