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急性梗塞發生后，作為實現準確和有效治療的第一步，臨床醫生需要快速且精確定位心肌缺血組織。現今早期心臟病發作的診斷基于生化血液分析（檢測心肌酶）或超聲波輔助成像，耗時且空間分辨率低。克服這些經典技術局限性的新技術也就應運而生，如納米技術。由此西班牙和中國研究人員S. Mateos等利用生物功能化的近紅外發光納米粒子，對急性心肌梗塞后的心臟進行了體內成像。利用近紅外熒光成像的*采集速度和納米粒子的高效選擇靶向性，在急性梗塞事件后僅幾分鐘就可獲得梗塞心臟的體內圖像。為急性梗塞后缺血心肌的高效、快速和準確的體內成像開辟了一條途徑。研究成果以“Instantaneous In Vivo Imaging of Acute Myocardial Infarct by NIR-IILuminescent Nanodots"為題發表于Small。

  背景

 心血管疾病（CVD）嚴重威脅人類健康，且影響越來越大，使得提高CVD診斷能力變得尤為關鍵。在心血管事件（如梗塞）早期，如果診斷及時，會大大提高康復治療的效果。此外早期診為減輕事件對患者的影響提供了更多時間，減輕了醫療系統的負擔。特別是急性心肌梗塞（心臟病發作）中，冠狀動脈閉塞事件引發心肌缺血和缺氧，通常導致不可修復的損傷和/或死亡，因此早期診斷、評估和治療顯得尤為重要。目前臨床對心肌梗塞的成像和診斷的依賴超聲成像（分辨率低）、生化血液分析（相對較慢）、磁共振成像（昂貴耗時）以及核醫學如x光血管造影、斷層攝影技術（昂貴且有害）。因此仍亟需開發新的成像技術，能夠在急性梗塞后對心臟進行低成本、快速和無電離輻射的可視化及診斷。

 隨著材料合成和修飾的進步，促成了基于使用納米粒子作造影劑的新診斷技術和療法。如基于磁性納米粒子、脂質體和多孔硅（PSi）納米粒子的梗塞心臟成像。但它們或者無法進行體內成像，或者需要昂貴的儀器。發光納米粒子（LNP）可以克服這些限制（表1）。但800nm以下熒光成像的固有局限性（如穿透深度差、與自發熒光的不良重疊）限制了這些納米粒子的臨床應用。此外使用LNP只能在梗塞后幾小時/幾天對梗塞心臟進行體內成像，仍無法實現快速（幾分鐘）體內診斷。

 近紅外二區（NIR-II）發光的LNP可解決800nm以下熒光成像的局限性問題。在NIR-II光譜覆蓋的1000nm-1700nm內，組織會隨著消光系數最小化而變得部分透明。此外NIR-II熒光成像可減少背景自發熒光和組織引發的散射。通過使用稀土摻雜的納米粒子、碳基納米粒子、半導體有機聚合物和納米粒子或半導體量子點（QDs），NIR-II體內熒光成像能力得到了驗證。其中Ag₂S納米點（nanodots, NDs）由于合成方便、亮度好、毒性小、生物相容性好而廣受關注，并已成功用于體內癌癥、血管成像、生物分布研究、光熱治療、非接觸式熱感應、放射診斷和心血管系統成像。其中一些應用對Ag₂S NDs進行表面修飾，使其與腫瘤等目標組織具有親和力。已知心肌事件期間，血管緊張素-腎素系統的血管緊張素受體1（AT1R）在心肌中過表達，為實現選擇性靶向缺血心肌組織提供了可能。AT1R的天然配體是血管緊張素Ⅱ（AngⅡ），Dvir等人通過將納米尺寸的PEG化脂質體連接到AngⅡ并搭載有機染料DyLight649，在梗塞后24h獲得了小鼠梗塞心臟的離體熒光圖像。AngⅡ-Ag₂S NDs也成功用于NIR-Ⅱ熒光成像離體Langendorff模型的心肌梗塞，證明AngⅡ的功能修飾有望實現心臟病發作的快速成像。但離體情況下的有效靶向性不代表其在體內同樣具有適用性。當進行全身靜脈注射的體內實驗時，蛋白冠的形成也會影響AngII-Ag₂S NDs的靶向能力。此外梗塞心肌組織的有效積聚還需要其他器官（如肝臟和腎臟）對AngII-Ag2SNDs的保留或清除作用最小化。

 本研究使用AngII-Ag2S NDs在心肌梗塞后的短時間（幾分鐘）內對心臟進行NIR-Ⅱ體內成像。進一步時程分析評估靜脈注射后缺血心肌組織中AngⅡ-Ag₂S NDs的選擇性積累速度。比較AngII-和PEG-功能化的Ag₂S NDs的生物分布模式，評估了AngII-Ag2S NDs的選擇性。

  結果

 圖1a為研究方法示意。結扎小鼠的冠狀動脈左前降支（LAD）30min誘導心肌梗塞，然后再灌注30min，引發受影響心肌組織中AT1R受體顯著過表達（圖1a）。再灌注后立即靜脈注射AngII-Ag₂S NDs（100μL，1.5mg mL^-1，眶后）。圖1b為AngII-Ag₂S NDs的透射電子顯微鏡（TEM）照片。通過1200nm光監控AngII-Ag₂SNDs與受損心肌組織的結合（圖1c），808nm二極管激光器以相對低功率密度（0.2W·cm^-2）照射，InGaAs紅外照相機收集和記錄Ag₂SNDs產生的熒光。在靜脈注射后的第一個小時內，每5min獲取一次熒光圖像。非靶向對照實驗采用PEG化的Ag₂S納米粒子（PEG-Ag₂S NDs）。兩種納米粒子表面修飾不同，但流體動力學半徑非常相似，接近10nm（圖1d，e），且已知這兩種不同的功能化不會在粒子的發射光譜中產生任何相關變化。



  圖1（a）體內成像實驗程序示意圖。（b）Ag₂S NDs透射電子顯微鏡圖像。（c）790nm光激發下Ag₂S NDs膠體懸浮液的發射光譜。（d，e）分別是AngII化和PEG化的Ag₂S NDs的DLS圖。

  圖2a為靜脈注射Ag₂S NDs后10min（誘導梗塞后40min）獲得的小鼠體內光學圖像、NIR-Ⅱ熒光圖像及融合圖像。包括進行梗塞手術并注射AngII-Ag₂S NDs（上）、手術并注射非靶向PEG-Ag₂S NDs（中），以及假手術（無梗塞）并注射靶向AngII-Ag₂S NDs（下）后獲得的NIR-II熒光圖像。可見上行顯示AngII-Ag₂SNDs在梗塞心臟優先積聚。相反，在沒有梗塞或使用PEG-Ag₂S NDs時，由于納米顆粒在肝臟中的滯留，在腹部有優先積累。圖2a的NIR-Ⅱ熒光圖像顯示AngII-Ag₂S NDs具有體內靶向能力，及其對急性損傷心肌組織的優先粘附。結果表明靜脈注射后，AngII-Ag₂S納米顆粒僅優先積聚在受損的心肌組織中，此時AngII為其表面配體。對照實驗表明在沒有靶向或沒有心肌梗塞的情況下，心臟中不會發生積聚。

 進行時程研究以評估優先靶向受損心肌的速度。圖2b為靜脈注射AngII-Ag₂S NDs后，三只誘發梗塞的小鼠心臟和肝臟中產生的NIR-Ⅱ熒光的平均時間演變，顯示AngII-Ag₂S NDs快速積聚于梗塞心臟。且積聚主要在靜脈注射后的qian10min內產生。圖2b包括肝臟中積累的Ag₂S NDs產生的NIR-Ⅱ熒光信號的時間演變。與在心臟觀察到的情況相反，肝臟產生的NIR-Ⅱ熒光信號隨時間單調下降，表明肝臟最初的滯留可能隨后逐漸釋放。圖2c為三只急性梗塞小鼠靜脈注射PEG-Ag₂S NDs后，心臟和肝臟累積產生的NIR-Ⅱ熒光強度的時間演變。這種情況下兩器官產生的NIR-Ⅱ強度的時間演變模式*不同。肝臟優先滯留，即使時間很短。靜脈注射后肝臟產生的NIR-Ⅱ強度幾乎保持不變，表明PEG-Ag₂S NDs在肝臟長期滯留。同時，心臟處沒有觀察到顯著的優先積累。注射后短時間內，PEG-Ag₂SNDs經循環系統出現在心臟中。然而PEG-Ag₂S NDs在心臟中產生的NIR-Ⅱ熒光隨時間單調減少。圖2d為假手術組的時間進程，顯示AngII-Ag₂S NDs在肝臟積累，且信號隨時間持續下降。短時間內在心臟中觀察到的最小信號也隨時間快速降低。表明在健康心臟中，AngII-Ag₂S NDs的積累可以忽略不計，也證明當沒有發生心肌梗塞時，AngII-Ag₂SNDs清除良好。圖2b-d的時間曲線不僅揭示AngII-Ag₂S NDs在急性心臟病發作后選擇性靶向受損心肌的適用性，此外短時間內（射后10min）即出現選擇性積聚，足以觀察到來自缺血心肌組織的清晰和特異性信號，證明了其快速診斷的能力。



  圖2 （a）三種情況下的光學、NIR-Ⅱ熒光和融合圖像。（b）急性梗塞并靜脈注射AngII-Ag₂S NDs后，三只小鼠心臟和肝臟中的平均NIR-Ⅱ發光強度的時間過程。（c）急性梗塞并靜脈注射PEG-Ag₂S NDs后，心臟和肝臟的平均NIR-Ⅱ發光強度時間進程。（d）非梗塞并注射AngII-Ag₂S NDs后，心臟和肝臟的平均NIR-Ⅱ發光強度時間過程。

 缺血小鼠和假手術小鼠靜脈注射AngⅡ-Ag₂S NDs后，記錄股動脈產生的發光強度的時間演變以評估粒子循環時間特征。兩種情況下，由血流中循環的AngII-Ag₂S NDs產生的NIR-Ⅱ熒光表現出持續約2min的初始增量，與注射的NDs*匯入血流中所需的時間相關。2min以后兩種情況下都觀察到強度單調下降。反映了NDs的循環時間有限，且與心肌是否有損傷無關。兩種情況下評估的衰變時間都是500s。因此可得出結論，不管心肌有無損傷，AngⅡ-Ag₂S NDs的循環時間約20min。
  為進一步證實圖2a中心肌檢測到的體內NIR-Ⅱ熒光信號與Ag₂S NDs的存在明確相關，在注射納米顆粒后1h處死動物，立即解剖心臟并通過NIR-Ⅱ光譜成像進行分析。圖3a為1000、1200和1500nm處獲得的體外心臟發光圖像。梗塞+AngⅡ-Ag₂S組（圖3a上）中，1000nm和1500nm都沒有觀察到發光，1200nm處的熒光圖像顯示心臟頂部產生清晰信號，該處心肌組織損傷最嚴重。而1200nm處檢測到熒光表明發光對比度是由AngⅡ-Ag₂S NDs提供的。圖3b為心臟頂部區域的發射光譜，與膠體懸浮液中Ag₂SNDs的發射光譜匹配良好（圖1c），表明觀察到的發光可歸因于AngⅡ-Ag₂S NDs對缺血心肌的選擇性附著。梗塞+PEG-Ag₂S組（圖3a中）中，1200nm處僅觀察到非常微弱的信號，表明NDs的積累很少。圖3b數據顯示該情況下的發射光譜是以1200nm為中心的寬帶，這可能是缺血心肌組織中存在少量PEG-Ag₂S NDs，似乎是缺血心肌組織滲透性和滯留效應（EPR）增強所致。最后，未梗塞+AngⅡ-Ag₂S NDs組（圖3a下）同樣在1000和1500nm處沒有觀察到信號，且1200nm處獲得的熒光圖像勉強高于背景。圖3b中的光譜與Ag₂S NDs的發射光譜不相似，表明在健康心臟中的累積可以忽略不計，同時為了增加AT1R的表達和累積，缺血事件是必要的。

 氯化三苯基四氮唑（TTC）染色進一步證實了這些發現，證實對照心臟（假手術）沒有顯示損傷，梗塞的心臟的損傷組織主要位于jianduan。

 為進一步分析梗塞的存在和AT1R的過表達的關聯，對梗塞心臟樣本進行qt-PCR。圖3c為健康心臟（假手術心臟）和梗塞心臟的AT1R表達百分比。可見假手術組呈現AT1R低表達，而受損心肌組中顯著升高。將圖3c數據與圖3b中的發射光譜的積分強度相關聯（圖3d），顯示了AngII-Ag₂S NDs用于檢測缺血心肌的靶向效率，以及量化信息。圖3c中可見梗塞引發的AT1R表達的相對增加小于50%，而與AngII-Ag₂S NDs選擇性積累相關的NIR-Ⅱ熒光信號顯示增加了10倍，再次反映出AngII-Ag₂S NDs在短循環時間內的高效靶向性。



  圖3（a）三種不同發射波長（1000、1200和1500nm）下的離體熒光圖像，對應不同處理組。（b）對應的發射光譜。（c）假手術小鼠和心肌梗塞小鼠心肌組織中AT1R的mRNA水平。（**p < 0.01）。（d）健康心臟（假+ AngII-Ag2S）、靜脈注射PEG-Ag₂S NDs后的梗塞心臟（梗塞+PEG-Ag₂S）和靜脈注射AngII-Ag₂S NDs后的梗塞心臟在1000-1600nm范圍內的發射強度。
  最后通過評估生物分布模式，研究了AngII-Ag₂S NDs的AT1R靶向能力。獲得三種情況下各器官的NIR-Ⅱ發光圖像（圖4），顯示PEG-Ag₂S NDs優先在肝臟和脾臟中積累，而其他器官沒有出現明顯的紅外發光。無梗塞的對照組中也觀察到肝臟和脾臟積聚。而在梗塞后注射AngII-Ag₂S NDs的小鼠器官中，僅在心臟和肺中可見發光，沒有觀察到肝或脾對AngII-Ag₂SNDs的實質性保留，與圖2b數據非常一致。但對每個器官中的發光進行單獨定量證明有殘余發光信號，證實肝臟和腸道中均存在Ag₂S NDs。生物分布模式（圖4b,c）顯示，對于梗塞和健康心臟，一些熒光是從肝臟、脾臟和腸道產生的。然而以圖4a中最大強度標準化后，很難直接觀察這些特定器官的熒光。分析肝臟和腸的離體熒光圖像表明，PEG-和AngII-功能化的Ag₂S NDs通過膽汁途徑和糞便排泄優先清除，與已有研究結論一致。肺中AngⅡ-Ag₂SNDs的積聚可解釋為肺泡-毛細血管屏障功能障礙，這可能導致肺充血。此外，即使使用傷害最小的huxiji，機械通氣可能也會引發huxiji引起的肺損傷（VILI）。肺血管緊張素受體的上調可能是炎癥反應的一部分。

 
 圖4（a）不同處理小鼠解剖離體器官的NIR-Ⅱ熒光圖像。（b）急性梗塞后靜脈注射PEG-Ag₂S NDs和（c）AngII-Ag2SNDs，在不同器官中產生的發光強度直方圖。

 結論

 本研究使用近紅外二區發光的Ag₂S NDs實現了急性梗塞后快速、高選擇性的體內心臟成像。結果證明急性梗塞后AT1R受體的過表達可使靜脈注射的AngII-Ag₂S NDs瞬時（< 10min）并選擇性靶向缺血心肌組織，使得在最早的時間內對急性梗塞損傷心臟進行體內可視化成為可能。與離體器官光譜圖像的比較再次證明了AngII-Ag₂S納米粒子的高特異性，即使全身注射也能附著到缺血性心肌組織。

 本研究介紹的近紅外二區發光納米粒子可在小動物模型中對急性梗塞后的心臟進行快速體內成像和診斷。這是臨床前心肌梗塞早期快速診斷的第一步，有助于開發新的治療方法。此外AngII-Ag₂S NDs的高靶向能力也為新療法開啟了思路，如藥物遞送或利用Ag₂SNDs實現同時局部高熱和非接觸式熱傳感。
  參考文獻：Mateos S ,  Lifante J ,  Li C , et al. Instantaneous In Vivo Imaging of Acute Myocardial Infarct by NIR-II Luminescent Nanodots[J]. Small, 2020.