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抗生素問(wèn)題

建議和解決方案

增加甘油原液的接種量通常可以獲得更好的質(zhì)粒產(chǎn)量。

質(zhì)粒上復(fù)制的起源可能固有不同類(lèi)型的拷貝數(shù)。VectorBuilder生產(chǎn)的一些質(zhì)粒載體是中拷貝或低拷貝型，因此它們的質(zhì)粒在大腸桿菌中的復(fù)制頻率低于高拷貝質(zhì)粒劑量。為了制備低拷貝質(zhì)粒，增加用于制備的大腸桿菌培養(yǎng)物的量，以獲得令人滿意的DNA產(chǎn)量。

在大腸桿菌培養(yǎng)中正確使用抗生素對(duì)于獲得高質(zhì)粒產(chǎn)量至關(guān)重要。首先，請(qǐng)仔細(xì)閱讀甘油儲(chǔ)備管上的標(biāo)簽，并確保你使用的是與質(zhì)粒上的抗生素耐藥性基因相對(duì)應(yīng)的抗菌藥物。濫用抗生素會(huì)抑制細(xì)菌繁殖。其次，一些抗生素，如氨芐青素，在液體培養(yǎng)中降解快。因此，不含質(zhì)粒的細(xì)菌可以繁殖到培養(yǎng)物的很大一部分，導(dǎo)致質(zhì)粒制劑的產(chǎn)量很低。為了避免這種情況，請(qǐng)?jiān)谑褂们靶迈r制備含有氨西林的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，并確保提供足夠的氨西林。此外，當(dāng)培養(yǎng)氨西林抗性細(xì)菌時(shí)，不要讓液體培養(yǎng)物在收獲前很長(zhǎng)時(shí)間飽和。

EndA'應(yīng)變

EndA*菌株保留了表達(dá)EndA核酸內(nèi)切酶的能力，這會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒制備產(chǎn)品中的質(zhì)粒DNA降解。要去除核酸內(nèi)切酶，請(qǐng)?jiān)?span>DNA清除步驟中對(duì)質(zhì)粒制備柱進(jìn)行額外清洗，或者最好使用EndA菌株進(jìn)行克隆

微生物污染

如果你需要在沒(méi)有抗生素的環(huán)境中培養(yǎng)大腸桿菌，請(qǐng)非常小心，以免發(fā)生微生物污染。沒(méi)有轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的微生物往往會(huì)更快地繁殖，并在細(xì)菌培養(yǎng)中占據(jù)主導(dǎo)地位，因?yàn)橘|(zhì)粒復(fù)制會(huì)消耗細(xì)胞分裂的能量。如果污染已經(jīng)發(fā)生，請(qǐng)用75%的乙醇清潔您的工作臺(tái)和軌道搖瓶。確保您的培養(yǎng)瓶和移液管端經(jīng)過(guò)良好消毒。你還需要用某些抗生素在瓊脂平板上篩選正確的菌株菌落。

噬菌體污染

噬菌體污染可能導(dǎo)致細(xì)菌培養(yǎng)中的細(xì)胞裂解。如果發(fā)生噬菌體污染，立即扔掉受污染的培養(yǎng)物，丟棄所有用于制備細(xì)菌培養(yǎng)物的溶液。用0.05%氫氧化鈉溶液仔細(xì)清潔工作臺(tái)表面和軌道振蕩器。所有用于細(xì)菌繁殖的培養(yǎng)瓶也應(yīng)通過(guò)浸泡法用氫氧化鈉溶液清洗，然后進(jìn)行高壓滅菌。同樣地具有fhuA突變的大腸桿菌菌株，如VB UitraStable“"化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，優(yōu)選用于克隆，因?yàn)樗鼈儗?duì)T1噬菌體表現(xiàn)出抗性。

序列對(duì)齊

確定兩個(gè)序列彼此之間的相似或不同程度是推斷兩個(gè)序列之間的結(jié)構(gòu)、功能或進(jìn)化關(guān)系的常用方法。VectorBuilder的序列比對(duì)工具不僅可以在DNA或蛋白質(zhì)水平上直接比較兩個(gè)序列，還可以基于翻譯比較兩個(gè)DNA序列。

比對(duì)提供了整個(gè)序列的同一性/相似性百分比的全局視角，以及比較單個(gè)核苷酸/氨基酸的重點(diǎn)視角。該工具利用間隙和間隙懲罰來(lái)最大限度地提高匹配兩個(gè)核苷酸或氨基酸的機(jī)會(huì)，同時(shí)保持?jǐn)?shù)據(jù)的完整性。雖然間隙說(shuō)明了對(duì)齊序列中的插入或刪除，但間隙懲罰根據(jù)間隙的頻率和長(zhǎng)度為對(duì)齊分配負(fù)分?jǐn)?shù)。

GC內(nèi)容計(jì)算器

DNA模板的GC含量是決定將靶基因成功克隆到所需主鏈中的關(guān)鍵因素。具有高GC含量的基因模板通常導(dǎo)致形成自二聚體或二級(jí)結(jié)構(gòu)的更高機(jī)會(huì)，并且需要更高的退火溫度。

該工具允許您確定整個(gè)基因序列以及基因內(nèi)特定區(qū)域的GC含量。當(dāng)輸入DNA或RNA序列時(shí)，計(jì)算每個(gè)堿基類(lèi)型的數(shù)量和百分比。通過(guò)調(diào)整窗口大小，可以在圖形讀出中可視化序列中較小或較大片段的GC內(nèi)容。

DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)

預(yù)測(cè)由轉(zhuǎn)錄的DNA形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)在各種分子生物學(xué)技術(shù)中很重要，包括siRNA設(shè)計(jì)和克隆優(yōu)化。將您的序列粘貼到下面，并接收預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的圖形輸出。自由能最小化用于確定堿基對(duì)之間的相互作用，突出潛在的莖和環(huán)的形成。

RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成

我們可以根據(jù)不同的組織水平來(lái)檢查細(xì)胞成分的活性。核酸或蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)分別是核苷酸或氨基酸的基本序列。DNA的主要結(jié)構(gòu)是ATGC序列的列表。基于附近組分之間的相互作用，分子將形成其穩(wěn)定、低自由能的構(gòu)象。對(duì)于DNA來(lái)說(shuō)，這種二級(jí)結(jié)構(gòu)是由兩條互補(bǔ)核苷酸的長(zhǎng)鏈相互纏繞形成雙螺旋的結(jié)果。這兩個(gè)股線及其所得的二級(jí)結(jié)構(gòu)具有高水平的穩(wěn)定性。

然而，一旦被轉(zhuǎn)錄，RNA就會(huì)形成單鏈核苷酸。這種形式不太穩(wěn)定，核苷酸將尋求與互補(bǔ)核苷酸形成氫鍵：A與U，C與G，G與U。如果沒(méi)有像DNA中發(fā)現(xiàn)的互補(bǔ)鏈，單個(gè)RNA鏈將自身折疊成較低的

圖1。單鏈信使核糖核酸可以自我折疊形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。

形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)RNA的功能有很大影響，無(wú)論是編碼還是非編碼，RNA結(jié)構(gòu)在基因功能和調(diào)控中都起著重要作用。確定這種結(jié)構(gòu)可以極大地幫助實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和故障排除。我們的二級(jí)結(jié)構(gòu)工具提供了RNA鏈低自由能構(gòu)象的圖形布局。

用戶說(shuō)明：甘油原液

檢索矢量信息

你的向量有一個(gè)未染色的向量lD，打印在甘油儲(chǔ)存管上。您可以通過(guò)VectorBullders主頁(yè)wectorbullder上的“Reteve Veccior informatlon"鏈接，使用thls lD來(lái)檢索矢量圖、矢量序列和矢量組件公告。

存儲(chǔ)

在溫和的溫度下，混合物以E，coll甘油原液（15%甘油）的形式存在。我們強(qiáng)烈建議您在冷凍vlal之前接種Le llquld培養(yǎng)基。在打開(kāi)管子之前，請(qǐng)先做一次快速旋轉(zhuǎn)，以從ld中取出reslual llould，避免交叉污染。

arig

甘油原液可放入-80℃中長(zhǎng)期保存。我們還建議您單獨(dú)制作甘油庫(kù)存作為備用。甘油散裝物應(yīng)僅放置在4’c短期儲(chǔ)存（2周）中。

接種

甘油原液來(lái)自單個(gè)克隆。你可以用它直接接種LB培養(yǎng)基。然而，在某些情況下，這種方法可能導(dǎo)致液體培養(yǎng)物的DNA yfeld較低。如果你連E，這個(gè)問(wèn)題通常會(huì)消失。首先將菌落放在平板上，當(dāng)菌落全新鮮時(shí)，用一個(gè)菌落接種液體培養(yǎng)物。如果DNA含量低，請(qǐng)重新轉(zhuǎn)化，并克隆一個(gè)菌落接種新的lB菌株。如果你在后續(xù)工作中使用從原始甘油庫(kù)中提取的芥子菌集落，那么這個(gè)集落相對(duì)于母體庫(kù)獲得突變的可能性很小。因此，我們建議您在進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)之前，通過(guò)測(cè)序和限制性內(nèi)切酶來(lái)評(píng)估菌落（或幾個(gè)菌落）的正確性。

要從未冷凍的糖霜中接種，請(qǐng)將一微濾器的糖霜輕輕地滴入補(bǔ)充有適當(dāng)抗洗劑的混合液中。如果是從冷凍的甘油原液中接種的，用一個(gè)sterle plpette端刮下一小塊冷凍原液，然后小心地將端扔到llquld Le medlum中。你也可以先在LB平板上劃線，然后選擇一個(gè)菌落接種LB液體。

一些載體，特別是那些大小較大、序列重復(fù)或Gc含量異常的載體，可能有發(fā)生重排（如缺失）的趨勢(shì)。減少這種可能性的一種方法是在30℃的平板上培養(yǎng)大腸桿菌，并在培養(yǎng)基中代替標(biāo)準(zhǔn)的37℃。

抗生素濃度

打印在甘油儲(chǔ)備管上的載體ls的antblotic restance。請(qǐng)使用LB板或lg培養(yǎng)基中的抗菌劑，濃度如下。

Amplcllin:100μg/ml卡那素:50μg/ml

氯素：34微克/毫升

四環(huán)素：5微克/毫升

steptomycin:50ugiml

慶大素：10 pgiml

宿主菌株

請(qǐng)注意甘油儲(chǔ)備管上打印的大腸桿菌宿主菌株信息。大多數(shù)載體是在Stbl3宿主中構(gòu)建的，以確保序列的穩(wěn)定性。某些應(yīng)用程序需要使用其他主機(jī)。例如，來(lái)自pET載體的重組蛋白表達(dá)通常需要攜帶T7 RNA聚合酶基因的大腸桿菌宿主，如BL21（DE3），在這種情況下，來(lái)自Stbl3宿主的載體需要再轉(zhuǎn)化到合適的宿主中。

特別通知

VectorBuilder為我們構(gòu)建的載體提供100%的序列保證。如果您決定進(jìn)行獨(dú)立驗(yàn)證，強(qiáng)烈建議使用Sanger測(cè)序，這是金標(biāo)準(zhǔn)分析。如果出現(xiàn)下一次操作測(cè)序（NGS或Nanopore seauencina）所稱的測(cè)序錯(cuò)誤，請(qǐng)?jiān)诼?lián)系我們獲得售后支持之前仔細(xì)檢查buSanger測(cè)序的結(jié)果。我們最近注意到，在許多情況下，Nanopore測(cè)序的錯(cuò)誤率很高。

疑難解答：質(zhì)粒DNA產(chǎn)量低

可能的原因

接種物太小

質(zhì)粒的拷貝數(shù)各不相同

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