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1.節苷脂的微量分離和純化方法 Stephan Ladisch ~ 兒童國家醫學中心癌癥和移植生物學中心主任，華盛頓特區2010這種溶劑分配方法允許從小樣品和節苷脂濃度低的樣品中分離節苷脂，特別是相對于潛在污染蛋白質和其他大分子量物種的濃度。該方法包括三個步驟: (1)制備干式總脂提取物; (2)在二異丙醚/1-丁醇/NaCl 水溶液中對總脂提取物進行分配; (3) Sephadex G-50凝膠排阻色譜法。最終的總節苷脂制劑被凍干并保存在干燥狀態。凍干細胞、血漿或組織的總脂提取物。干燥后的總脂提取物在 DIPE/1-丁醇/鹽水相和有機相之間的分配。Sephadex G-50凝膠過濾去除含節苷脂水相中的低分子污染物。1.總脂提取 1.總脂提取物: 氯甲醇方案: 1。將樣本(細胞、血漿、均質組織)放入適當大小的圓底玻璃管或燒瓶中凍干(即30倍組織或血漿體積)。2。用玻璃棒將凍干的樣品粉碎成細粉。加入氯仿: 甲醇(C: M)1:1。(20體積/克濕重組織或細胞，10體積/毫升血漿或血清)。用超聲波將固體分散在浴室超聲波儀中，用 N2和蓋子蓋緊橡皮布。(濕萃取，首先加入10卷。攪拌甲醇，然后10伏。氯仿)。3。第一次提取18小時。用磁力攪拌，在4 °C 下攪拌。4。每分鐘2000轉的離心管(750克，10分鐘).仔細傾倒全透明的上清液，不要轉移任何顆粒物質，并處理下面的每個(6)上清液。第二次提取用新鮮 C: M 1:1的額外原始體積重新提取總固體材料; 使用新鮮溶劑首先沖洗(4)中使用的離心管，然后將這些沖洗在原始提取燒瓶中。提取4小時。在4 °C 的 N2下攪拌，然后像(4)中那樣加工第二種提取物。

6.Rotovap (浴溫不高于20-25 °C)將(4)和(5)的組合上清液的體積減少到組合總體積的1/4。此時過夜冷卻至零下25攝氏度以沉淀蛋白質。像上面一樣再次離心，恢復透明上清液。定量地將這種濃縮的總脂提取物轉移到離心管(# 8142)中，在離心管中進行 DIPE/丁醇分離。保存顆粒直到后的 G-50階段，以防再加工是必要的。用一股 N2蒸發上清液至干燥，并用凍干法除去殘留的溶劑痕跡。注: 第一提取物去除了90% 以上的節苷脂，第二提取物中剩余的10% 與第一提取物沒有質的區別，冷卻至 -20 °C 時去除的沉淀物中不含節苷脂。使用的 C: M 的體積沒有被發現在一個合理的范圍內是關鍵的。我們已經使用了多達10毫升/108細胞(即更高的體積) ，與通常的10-20體積相比，對回收率沒有影響。2.DIPE/1-丁醇/鹽水分隔

材料: 二異丙基醚1-丁醇，試劑級雙蒸餾去離子水(ddH2O)鹽水溶液: 0.1% NaCl 或0.3% NaCl15或50ml 玻璃錐形離心管，聚四氟乙烯內襯蓋(# 8142)方案: 階段: 有機: 2體積 DIPE/1-丁醇，60:40v/v 水: 1體積鹽水溶液。1% 氯化鈉: 每109個細胞的總脂提取物10毫升鹽水(最小體積為1毫升)。血漿: 對于血漿，使用 ddH2O: 2.0 ml ddH2O/總脂提取物1ml 血漿，最小水溶性容積為1ml。放射標記的細胞節苷脂: 1.0毫升最小體積的生理鹽水(使用少至106個細胞)。組織: 對于組織，使用0.3% NaCl: 109個細胞 = 1克組織，因此每克組織使用10毫升生理鹽水。注意: 以下程序步驟的細節是至關重要的，必須遵守。一旦開始步驟(1) ，則應立即執行步驟(7)中的程序。在總脂提取物中加入有機(DIPE/1-丁醇)相，旋渦，超聲波直到樣品全分散。可能會產生乳白色的溶液，但是大顆粒必須在進入(2)之前被分散。加生理鹽水。3。執行2分鐘。交替渦流與超聲波的結合。離心機10分鐘。轉速為2000轉(750xg)。5。從較低的水相中去除較高的有機相(與水相存在時，留下輕微的界面乳狀液)。添加新鮮有機相的原始體積，重復步驟(3)、(4)和(5)進行第二次分區。注: 隨后的節苷脂放射自顯影研究有兩個分區，需要最高定性純度的組織和血漿樣品最多有三個分區。7。通過用 N2流去除溶劑痕跡，冷凍和凍干，準備最終的水相(含節苷脂)用于下面的 STEP (3)。

3.Sephadex G-50凝膠過濾

材料：

葡聚糖凝膠G-50（150）

洗脫液：雙蒸餾去離子水（ddH2O）

紫外線監測儀和記錄儀，在206nm處測量

協議：

將樣品重新溶解在適當體積的（ddH2O）中，短暫超聲以確保膠束形成，并加載有時著色但始終透明的水相。在空隙體積（峰1）中回收節苷脂，然后將其凍干并重新溶解在小體積的C:M 1:1中。離心樣品，在清澈上清液中定量回收神經節甙脂。沉淀物含有在總脂質提取步驟中共提取的殘余蛋白質。

參考文獻：

（1） Ladisch，S.和Gillard，B.（1985）用于微規模節苷脂純化的溶劑分配方法。分析生物化學146:220-231。

（2） Ladisch，S.和Gillard，B.（1987）從血漿中分離和純化節苷脂。《酶學方法》138:300-306。

典型柱條件：

床體積流速（ML/MIN）最佳（最大）樣品裝載量裝載樣品的節苷脂總含量

10-15毫升0.25 0.3（0.7）5-20 80-100%

40毫升0.6 0.5（1.5）20-50 100%

90毫升1.2 1.5（3.0）70-5400 93-100%

 

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