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RNA 在調控和基因表達中起重要作用，并在植物生長發育過程中發揮作用。因此，獲得充足且高質量的植物RNA產量對許多生物科學領域至關重要。

植物 RNA 的幾個特征使其提取具有挑戰性。在本文中，我們將討論這些特征、RNA 的類型、植物 RNA 提取的主要步驟、如何量化產量和驗證植物 RNA 的質量，以及更好地提取植物 RNA 的一些技巧。

什么是RNA？

RNA是分子核糖核酸的縮寫。RNA是每個生物體非常重要的分子。它由四種類型的核糖核苷酸堿基組成，稱為腺嘌呤 (A)、胞嘧啶 (C)、鳥嘌呤 (G) 和尿嘧啶 (U)。有時，將 RNA 比作參考書上的副本（在這種情況下來自 DNA）。

 

RNA 是單鏈分子，含有核糖（而不是 DNA 中存在的脫氧核糖）。核糖含有用 OH 表示的羥基。這些羥基使 RNA 更具反應性并易于水解，從而導致分子不穩定并使其更容易降解。由于其不穩定性，操作 RNA 時必須更加小心。

RNA的類型

在植物中，您可以識別三種主要類型的 RNA：

 

信使 RNA (mRNA)：一種轉錄 DNA 序列并編碼蛋白質或調節產物的分子。

核糖體 RNA (rRNA)：這種 RNA 是核糖體結構的一部分，對所有生物體的蛋白質合成至關重要。rRNA 構成了核糖體中的主要物質，按重量計大約為 60% 的 rRNA 和 40% 的蛋白質。

轉移 RNA (tRNA)：這種類型的 RNA 分子將 mRNA 序列解碼為蛋白質。tRNA 在翻譯（從 mRNA 分子合成蛋白質的過程）期間在核糖體的特定位點發揮作用。

這三類RNA在每個細胞中所占的比例各不相同：mRNA約占總RNA的2.0-2.5%，tRNA約占14%，而絕大多數被rRNA占據（約80%）。正如您稍后將看到的，這些比例在確定 RNA 提取的質量方面起著重要作用。

除了上面列出的 RNA，研究人員還在植物和動物中發現了許多其他類型的 RNA。

此外，還有一些 RNA 僅對植物具有特異性，例如葉綠體 RNA。

 

與在線粒體中發現 RNA 的方式類似，葉綠體中也存在 RNA。這些細胞器（線粒體和葉綠體）中的 RNA 由內共生理論解釋。該理論指出，真核細胞中的線粒體和葉綠體曾經是被大型厭氧細菌攝取的需氧細菌。因此，植物具有三種*不同的 RNA：核、線粒體和葉綠體。

 

 

為什么提取植物RNA這么難？

植物 RNA 的問題在于提取通常會產生較低的 RNA 質量和產量。

 

您可能知道，植物的細胞中有很多代謝物。它們含有蛋白質、脂質、多糖和次生代謝物，僅舉幾例。

 

由于裂解步驟，所有這些代謝物在 RNA 提取過程中都變得混合，在此過程中必須破壞植物膜以釋放 RNA。

 

分離好的 RNA 的困難在于這些代謝物的大量存在。它們在結構上類似于核酸并與 RNA 共沉淀，從而降低了提取的產量和質量。此外，氧化多酚（作為醌）等次級代謝物不可逆地與核酸結合并作為下游應用的抑制劑或可能降解 RNA。

 

使植物 RNA 提取更加困難的其他一些條件包括：許多植物樣品中固有的高水平 RNases（降解 RNA）、低濃度的 RNA（由于含水量高）和纖維組織，如木質素（木材) 難以分解和移除。

 

同樣，分離高質量的 RNA 對下游應用至關重要。

植物RNA的應用

RNA 在許多不同的技術中非常有用，可以理解基因調控和表達。RNA 用于傳統應用，例如：

 

逆轉錄聚合酶鏈反應 (RT-PCR)，

定量 RT-PCR (RT-qPCR)

互補 DNA 合成 (cDNA)

Northern印跡

對于高級方法，RNA 用于：

 

差分顯示 (DD)

抑制消減雜交 (SSH) 文庫構建

RNA-Seq（研究特定條件下生物體中存在的所有RNA的轉錄組或集合）

染色質免疫沉淀

新一代測序 (ChIP-Seq) 實驗。

 

植物RNA的提取方法

已經發布了數以千計的植物 RNA 提取方案。但是，大多數報告的協議都基于三種方法：

 

基于苯酚的方法：基于苯酚的方案主要用于具有高濃度次生代謝物的植物。苯酚通常與氯仿結合以去除多糖污染物。

基于 Trizol 的方法： Trizol 已被用于從特定組織（如擬南芥種子）中提取 RNA 。Trizol 是一種市售試劑，它在單一溶液中結合了苯酚和異硫氰酸胍，以便在快速分離過程中產生高產量的 RNA。在該方法中，trizol 與氯仿、異丙醇和乙醇在無 RNase 的水中結合以去除污染物。

基于 CTAB 的方法：十六烷基基溴化銨或基于 CTAB 的方法已用于具有高多糖、次級產物或高水平 RNase 的植物樣品。CTAB 提取緩沖液基本上由 2% 十六烷基基溴化銨、1% 聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)、100mM Tris-HCl、1.4M NaCl 和 20mM EDTA 組成。這種方法首先去除多糖，然后是蛋白質，最后是次生代謝物。該方法還可以包括濃度約為 0.5% 的十二烷基硫酸鈉 (SDS)。SDS 是一種去污劑，可與蛋白質形成復合物，有助于在提取過程中去除蛋白質污染物。

 

 

植物RNA提取的主要步驟

大多數 RNA 提取可以分為四個步驟：

 

均質化：可以新鮮或冷凍獲得組織。此外，當沒有合適的實驗室條件時（如從現場工作中收獲），樣品可能會保存在高鹽溶液中，如“RNA 后期試劑"（室溫），直到在實驗室中處理。使用新鮮或冷凍組織沒有一般規則，因為要求取決于實驗和植物組織。然而，一旦樣品準備好，它通常被放置在研缽中，并在研杵的幫助下，在加入緩沖提取溶液之前將組織研磨成細粉。在其他情況下，研究人員可以使用帶有珠子的均質器，這有助于將組織粉碎成粉末。

分離：一旦組織變成細粉，加入緩沖液提取液。在這種情況下，可以使用任何苯酚、trizol 或 CTAB 緩沖液提取溶液。此步驟的目的是裂解細胞以釋放 RNA。然而，這是關于污染的關鍵步驟，因為當膜破裂時，所有細胞內容物都會同時釋放。這意味著 RNA 與所有其他細胞成分結合，多糖和多酚等代謝物現在可以與 RNA 更緊密地接觸。同時，RNAses 也開始工作，從而增加了 RNA 降解的風險。一些提取溶液的作用類似于 RNA 酶抑制劑，可減少 RNA 損傷的機會。

清除：在此步驟中，使用不同的互補試劑去除污染物，例如多糖、蛋白質和次級代謝物，以及其他可能的污染物。氯仿和異丙醇等試劑分別用于去除多糖/二級代謝物和蛋白質。此外，污染的基因組 DNA 可以使用基于柱的或基于酶的方法去除。

沉淀：此步驟用于純化和清潔下游應用最終溶液中的 RNA，并進一步去除任何額外的污染物。在這里，乙醇 70%、用 0.1% (v/v) 焦碳酸二乙酯 (DEPC) 或無 DNase 和無 RNase 的水處理的水可用于保存提取的 RNA。最后，一旦 RNA 溶解在這些試劑之一中，RNA 必須儲存在 -80°C。

植物RNA提取的關鍵試劑

盡管在 RNA 中使用了許多解決方案，但在本文中，我們選擇了六種對大多數 RNA 提取協議非常重要的試劑/解決方案。

 

裂解緩沖液：這是為了打破細胞膜并促進 RNA 的釋放。這通常是 Trizol、苯酚或 CTAB 緩沖液。

氯仿：這是一種通常用于去除多糖的試劑。一些協議建議使用氯仿進行兩次洗滌以獲得更好的結果。

異丙醇：該試劑有助于去除蛋白質。

乙醇：該試劑用于沉淀步驟。通常，RNA 在 70% 乙醇中沉淀。

無 RNase 和 DNase 水：這些用于 RNA 協議所需的所有解決方案。此外，這種類型的水可以在市場上買到，也可以用 DEPC 處理過的水代替。DEPC 處理過的水是通過將一定體積的蒸餾水與 DEPC 試劑 (0.1% v/v) 混合來制備的。

RNase： RNases 像RN a se A是一種嘧啶特異性酶，可降解胞嘧啶和尿嘧啶殘基處的單鏈 RNA。GoldBio 提供出色的RN a se A，可幫助您進行 RNase 保護分析和 RNA 序列分析。

 

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