細胞系在生物科學中被廣泛使用，它們無限增殖的能力意味著，從理論上講，科學家們可以精確地復制以前的研究重現實驗結果或者在此結果基礎上做更深入的研究。但是細胞系被貼錯標簽或處理不當會導致有問題的細胞系的錯誤識別，污染和/或傳播，進而可能影響研究數據的有效性和準確性。

科學研究中所用細胞系的真實性驗證是基礎而且必要的。真實性驗證能夠確保細胞沒有鑒定錯誤、沒有交叉污染、遺傳上與起始保存樣品沒有差異。那在科學研究工作中應該如何選擇所需要的細胞？如何獲取實驗所需細胞？所選用的或得到的細胞可靠性如何？如何判斷？這些問題對于需要使用細胞進行研究工作的科研人員是必須首先解決的問題。希望大家能在接下來的內容中找到答案。

一、細胞來源
細胞系可以 1) 直接從各種正常組織直接取材，進行原代培養，2) 可以從其他實驗室獲得，3) 也可以從細胞庫購買。無論采用何種來源，都必須確保對細胞進行身份驗證，并且沒有污染，例如支原體。那不同來源的細胞需要注意哪些問題呢？
1、直接取材，進行原代培養獲得
從新鮮組織中衍生出一種新的細胞系，特別是人類細胞，是一項昂貴且費時的工作。新細胞系的后續價值將取決于驗證其來源的能力以及相關的可用信息。這些信息包括細胞來源組織，臨床資料，其他相關信息。
（1）細胞來源組織：首先需要獲得捐助者或患者的同意和/或道德審查許可。另外，要記錄組織來源，進行組織病理學驗證，與正常組織進行比較。
（a）將用于原代培養的一小部分樣品（或血液樣品或來自供體的 DNA）立即冷凍或處理。然后可以使用組織或 DNA 明確證明該細胞系源自推定的供體。盡管基因型（核型，拷貝數變異（CNV）作圖分析，甚至全基因組序列）的其他信息有時會有助于確保身份，但建議采用短串聯重復序列（STR）進行身份驗證。
（b）理想的情況是，用于組織病理學驗證的組織最好由同一組織病理學家報告手術標本。如果患者樣本由臨床醫生直接提供給實驗室，則此步驟特別重要，因為它可能無法代表發送給組織病理學家的手術樣本。例如，它可能距腫瘤一定距離并因此缺乏癌細胞，或者可能來自不受遺傳或表觀遺傳缺陷引起的特定病理學影響的區域。
（c）少量血液（例如 10 毫升）或正常組織應冷凍。該組織以后可用于尋找遺傳差異，也可用于身份驗證。對于 iPSC 品系，或當使用直接重編程從一種衍生出另一種體細胞類型時，冷凍保存所用原始細胞的儲備液也是一種好習慣。這些對于使用新的重編程技術衍生出其他細胞系可能很重要，而且對于提供原始供體材料以驗證使用該細胞系的后來發現也可能很重要。如果使用體細胞核移植（SCNT）或「克隆」技術來衍生細胞系，例如 ES 細胞，則應分別保留來自體細胞供體和卵母細胞供體的細胞或組織，以匹配核和線粒體 DNA。

（2）臨床資料：如果捐贈者或患者表示同意并經過道德審查，則應盡可能多地記錄和存儲以下盡可能多的信息。用于明確識別捐贈者的信息（包括姓名，醫院編號，地址和出生日期）應以更高的安全性存儲，最好與其他數據分開存儲。在英國，需要 NHS 合同或名譽合同來獲得患者詳細信息，并且此類信息切勿與未經授權的同事共享或發布到公共領域。
（a）供體/患者的年齡和性別
（b）醫院和病理編號
（c）組織標本的起源部位和性質
（d）癌癥或其他綜合癥或病理的階段和等級
（e）組織病理學報告的副本
（f）臨床病史包括治療
（g）其他信息，例如腫瘤標記物狀態，遺傳信息和家庭數據等
（h）捐助者的知情同意和放棄商業權利的證據

（3）其他相關信息：關于該細胞系的起源和派生保留的信息越多，該細胞系對始發者和任何后續用戶有用的可能性就越大。這些信息包括：所有培養基和添加劑的類型，來源和批號以及建立細胞系的方法；使用抗生素情況，支原體檢測情況；細胞系是否經過基因修飾；對于 iPSC 或通過直接重編程衍生的細胞系，應描述所用方法，包括所用基因和載體等等。

2、從其他實驗室獲得
從其他實驗獲得細胞這種途徑存在許多潛在的危害。細胞系可能根本不是他們聲稱的那樣，并且不能保證它仍然是同一細胞系或具有與已發布描述的相同屬性。如果接收實驗室希望依靠通過細胞系獲得的歷史數據，則在接受進入的細胞系用于一般用途之前，應進行驗證。
在收到細胞細后，同時在在凍存之前，應使用已經批準的基于 DNA 的方法進行細胞系鑒定，以確認細胞系的起源并檢查錯誤識別。對照國際細胞系認證委員會（ICLAC）錯誤識別的細胞系數據庫來檢查細胞系名稱。在將新的細胞系存入液氮時應重新用 STR 對細胞身份進行驗證。人類細胞系可能攜帶病原體，包括病毒污染，對實驗室工作人員構成潛在的健康危害。它們還可能被細菌，真菌，支原體或病毒污染，并可能擴散到其他細胞系。如果要將這些細胞用于動物，必須對它們進行測試并證明不含相關病原體，這一點也很重要。否則這些病原體可能會對動物或者照顧動物的科研人員帶來危害。
新細胞系應在實驗室和儲存中進行隔離，直到對它們的來源進行鑒定，并證明它們不含微生物。最佳方法是擁有 II 級微生物安全柜（MSC）和專用于隔離區的培養箱。如果無法做到這一點，則應采取其他步驟以zui大程度地減少污染擴散的風險，其中包括（a）僅當當天所有其他細胞培養完成后才對新細胞系進行處理，（b）在進入普通培養箱之前，應應將新的培養物放置在專用培養箱中或密封容器中；（c）使用后，應使用合適的非腐蝕性消毒劑清潔 MSC，并在關閉前再運行至少 5 分鐘。
用戶還應確認他們獲得的細胞系適合于他們自己的特定目的。即使顯示出細胞系是真實的，它也可能會隨著傳代時間的延長而失去特定的關鍵特征。 核型分析是一種簡單的測試，可以揭示細胞系的變化。在開始工作之前確認適當的特性可以節省大量的時間和精力。

3、從細胞庫購買
學術機構或商業機構已經建立了許多保藏中心或細胞庫。這些來源的細胞系已經進行了驗證，并鑒定其在培養物中常見的污染微生物，因此除非隨附信息中另有說明，否則它們不太可能被污染或錯誤識別。但是，其中一些細胞系是在實驗室之間多次轉移后獲得的，因此，除非在分析證書中明確說明，否則不能保證真實性和不受微生物污染的影響。這些保藏中心或者細胞庫會對其細胞系進行常規驗證，并為細胞系提供分析證書，包括 STR 分型報告。

二、細胞儲存

一旦細胞系已經開發或獲得并驗證（即顯示為真實且未受污染），確保可靠且可重現的細胞供應的第一步是冷凍保存約 20 個 1 ml 安瓿瓶，每個安瓿瓶中裝有 1~5*10^6 個細胞。這將為絕大多數實驗室提供多年的現成貨源。通常是在防腐劑（通常是含有 10％DMSO 的生長培養基）中緩慢（通常 1 ℃ min-1）冷凍樣品來保存細胞系。某些細胞類型，例如 hESC，可能需要超速冷凍或玻璃化，其中水被原位冷凍形成玻璃，并且不允許像慢速冷凍一樣從細胞中滲透出來，通常用于冷凍干細胞。每次冷凍一批細胞時，建議立即復蘇一個小瓶以檢查其生存能力。從庫中取出的小瓶應快速融化（通過浸入 37°C 的水浴中），并用預熱的培養基逐漸稀釋細胞懸液。必須將可能具有傳染性的材料存儲在氣相液氮中，以減少污染性生物轉移的風險。安全起見，重要的物料（例如 MCB）可以分開儲存到一個以上的儲存容器中，最好在放置到不同的位置，做好使用的登記記錄。細胞的位置應在電子表格或數據庫中詳細說明，并與細胞系的起源和特征以及已應用的質量控制措施的詳細信息進行關聯。冷凍儲藏容器應裝有警報器，并定期檢查儲存溫度。建議每周至少一次記錄儲存容器中液氮的水平。對定期維護，監視和庫存控制的證據進行定期審核還將有助于確保存儲設施的安全性。

三、細胞錯誤識別
錯誤識別是由于交叉污染，控制不當或文書錯誤造成的，并暗示了良好的細胞培養方法（GCCP）的失敗；例如，將細胞意外轉移到培養基的儲液瓶中，該儲液瓶在 MSC 中同時具有兩個細胞系，貼錯了燒瓶或安瓿的標簽，或解凍了錯誤的安瓿。交叉污染的其他來源是飼養細胞（例如，在 ES 細胞培養中經常使用的）由于輻照或 siliemeisuC 處理不充分仍具有有絲分裂活性，或者是制備的條件培養基且未進行充分過濾以除去細胞。每當在實驗室中維持快速生長的連續細胞系時，就有可能交叉污染（即替換）其他生長較慢的細胞系的風險。我們可以從 ICLAC（ICLAC，2013a）獲得已知的錯誤識別的細胞系列表。但是，即使某個細胞系不在該列表中，實驗室也應始終進行測試以確保其自身的該細胞系庫存是真實的。因此，必須采取簡單的預防措施以zui大程度地減少細胞錯誤識別的可能性，這些措施包括：
（1）所有培養容器以及存儲容器都必須小心且正確地貼上標簽（包括細胞系的全名，傳代號和轉移日期）；
（2）生物安全柜一次只能使用一個細胞系。 取出細胞后，應在安全柜中用適當的液體消毒劑擦拭并運行至少 5 分鐘，然后再引入另一個細胞系；
（3）瓶或等分試樣只能用于一個細胞系；
（4）氣溶膠的形成必須控制在最小程度；
（5）應定期返還冷凍存量（除非必要，否則切勿細胞系連續培養 43 個月或 10 代）

四、細胞的真實性驗證
不管原代培養還是引進，細胞使用時仍需進行適當鑒定。培養細胞的鑒定主要有 6 個方面的要求：
1 證實其來源的物種
通過細胞遺傳學進行染色體檢測，進行細胞同工酶種類的檢測，一方面確認其起源物質，另一方面排除與其他種屬來源細胞的交叉污染。
2 與來源組織的關系
通過免疫細胞化學、RT-PCR、Western Blot 等方法，檢測細胞中特定分子的表達，確定細胞所在組織中的細胞類型；確定細胞所處的分化發育過程中的位置（例如, 干細胞階段、前體細胞階段或分化階段）。
3 確定細胞系是否轉化
通過體內移植，成瘤性觀察實驗，明確該細胞系是有限細胞系還是連續細胞系；細胞系是否表達惡性特征。
4 確定無細胞系交叉污染
通過細胞 DNA 分型（指紋、SSP、STR、SNP）分析，與細胞培養初代和同一來源組織、血液細胞 DNA 型進行比較，確認細胞系無交叉污染。也可通過同工酶檢測及細胞遺傳學檢測。
5 是否有跡象表明細胞系有遺傳不穩定的傾向性，易于轉化和表型的多樣性
通過染色體分析或 FISH 等檢測進行觀察和證明。
6 特定細胞系需要特征的證明
一組起源相同的細胞中的特定細胞系，挑選出的細胞株或雜交細胞系，需要提供該細胞系或細胞株特征的證明，如分子標記特征。

具體到每株細胞系，并不是所有的指標都進行實驗驗證。STR 分型分析是鑒定細胞系的標準方法。美國標準（ASN-0002 2011）提供了有關如何使用 STR 分析進行人類細胞系認證的信息。應遵循該標準的建議，包括使用至少八個核心 STR 基因座和應用匹配標準（匹配閾值 80％），以允許某些細胞系中發生少量遺傳漂移。

五、支原體污染
1950 年代shou次注意到細胞培養物被支原體污染，但令人遺憾的是仍然經常忽略它的存在。我們要清楚的知道如下幾點，對于我們在平常實驗中重視支原體污染問題非常重要。
（1）在世界范圍內，支原體污染非常頻繁。
（2）使用有支原體污染的細胞會導致錯誤，誤導或錯誤的實驗結果。
（3）由于缺乏明顯的體征，支原體陽性細胞培養可能不被注意。
（4）注意支原體污染的潛在來源
（5）使用良好的無菌技術和實驗室操作規程，避免支原體污染。
（6）對所有未經測試的細胞系采取有效的隔離程序。
（7）建立定期和連續的支原體檢測程序。
（8）科學期刊開始接受支原體檢測的證據，然后再接受論文發表。
支原體污染對宿主真核細胞的影響程度變化很大，但已顯示出它可以改變許多宿主細胞的功能，包括生長，形態，代謝，基因組和抗原性。因此，在實驗中使用被支原體污染的培養物將引來對所產生的任何研究數據的有效性和重要性的明顯質疑，并可能導致發表錯誤的實驗結果。現在越來越多的期刊在接受論文發表前要求提供證據證明研究中已使用細胞培養物不存在支原體的污染。

六、總結

1、啟動新的細胞系時，請記錄與組織起源有關的所有數據，并保留組織用于 DNA 分析。

2、確保新細胞系的名稱是唯yi的。

3、獲得的細胞系應來自可靠的來源，并且必須經過身份驗證以避免錯誤識別。

4、應當將經過身份驗證的細胞保存起來，以備將來使用，并定期從冷凍庫中更換培養物。

5、獲取細胞系組織有道德和法律上的要求。使用人體組織樣品通常需要患者同意，并且必須定義所有權。

6、將人體組織樣本作為可能具有傳染性的材料處理。

7、在開始實驗之前，為所有類型的實驗室廢物建立正確的處置途徑，確保工作人員接受適當的培訓。

8、從信譽良好的來源購買培養基和試劑（尤其是血清）。

9、記錄實驗所用的所有試劑和介質的批號。

10、建立「標準操作程序」（SOP）。良好的細胞操作規范可以很大程度上避免其他污染。

11、確保實驗室設備的所有物品（柜，培養箱，高壓滅菌器，水過濾裝置等）均得到適當維修，并在規定的范圍內工作。

12、錯誤識別仍然是一個主要問題，因此所有細胞系均應從可靠來源獲得并證明是真實的。

13、支原體的污染仍然很普遍，需要良好的組織培養實踐和頻繁的測試以確保細胞系清除污染。

迄今為止，只有少數的研究實驗室和科學期刊采取措施來改變繼續使用錯誤標識的細胞系的可怕局面，承擔著發布高質量受控數據的責任。毋庸置疑，期刊和科學協會的企業將極大地促進此類質量控制措施并加速其廣泛接受。讓我們大家共同努力，從你我做起，保證所發表的文章數據真實可信，可被重復。