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兩種野生大麥（Hordeum spontaneum L.）生態(tài)型對干旱脅迫的差異適應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組測序揭示了生態(tài)型特異性轉(zhuǎn)錄

摘要

背景：野生大麥在其地理分布范圍內(nèi)適應(yīng)高度多樣的環(huán)境。對來自對比環(huán)境的不同適應(yīng)野生大麥生態(tài)型進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序有助于鑒定與非生物脅迫耐受和適應(yīng)有關(guān)的基因和遺傳變異。

結(jié)果：在受控條件下，分析了來自沙漠（B1K2）和地中海（B1K30）兩種不同環(huán)境野生大麥生態(tài)型對干旱脅迫的響應(yīng)。沙漠生態(tài)型在灌溉和干旱條件下?lián)p失的水分較多，但相對含水量（RWC）和水分利用效率（WUE）均高于沿海生態(tài)型。我們用454平臺(tái)對兩種生態(tài)型干旱脅迫下的葉片的標(biāo)準(zhǔn)化cDNA文庫進(jìn)行測序，以鑒定干旱相關(guān)轉(zhuǎn)錄本。講閱讀量超過50萬次的每個(gè)生態(tài)型從頭組裝成20439個(gè)B1K2假定的*轉(zhuǎn)錄本（PUTs），21494個(gè)B1K30和28720個(gè)聯(lián)合組裝。每個(gè)生態(tài)型超過 50% 的 PUT 不與其他生態(tài)型共享。此外，16%（3245）的B1K2和17%（3674）的B1K30轉(zhuǎn)錄本在其他野生大麥生態(tài)型和栽培大麥中未顯示同源序列命中，并且是生態(tài)型特異轉(zhuǎn)錄本的備選。每個(gè)生態(tài)型的800多個(gè)*轉(zhuǎn)錄本與30多個(gè)不同的應(yīng)激相關(guān)基因同源。我們提取了1017個(gè)高質(zhì)量的SNPs來區(qū)分這兩個(gè)生態(tài)型。沙漠生態(tài)型與栽培大麥之間的遺傳距離比地中海生態(tài)型與栽培大麥之間的遺傳距離高1.9倍。此外，沙漠生態(tài)型比地中海生態(tài)型具有更大比例的非同義SNP，這表明這些生態(tài)型具有不同的來源歷史。

結(jié)論：結(jié)果表明，沙漠和地中海野生大麥生態(tài)型之間存在強(qiáng)烈的生理和基因組分化，地中海與栽培大麥的關(guān)系更為密切。大量野生大麥*的新轉(zhuǎn)錄本被鑒定。沙漠生態(tài)型中較高的SNP密度和較大比例的具有功能效應(yīng)的SNP表明地中海和沙漠野生大麥具有不同的來源歷史和自然選擇效應(yīng)。這些數(shù)據(jù)是改進(jìn)基因組注釋、干旱適應(yīng)轉(zhuǎn)錄組研究的寶貴基因組資源，也是未來大麥改良的新遺傳標(biāo)記來源。

圖1.不同土壤含水量下野生生態(tài)型大麥生蒸騰作用、葉片RWC和WUE的變化

Barley1K集合中的B1K2和B1K30種質(zhì)是根據(jù)先前的研究選擇的，因?yàn)樗鼈儗Ω珊档纳矸磻?yīng)存在差異。生理測量在溫室中進(jìn)行，植物保持在自然光條件和半控制的溫度和濕度下（圖 1A-D）。測量的性狀包括午間全株蒸騰量 (E)、體重增加，損失，這些都根據(jù)植物葉面積、水分利用效率 (WUE) 和葉相對含量 (RWC；參見方法) 進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化。出乎意料的是，在灌溉良好（80% 體積含水量）和干旱條件（30% 體積含水量；圖 1E）下，沙漠生態(tài)型比地中海生態(tài)型品種損失更多的水分。盡管其蒸騰速率較高，但在干旱條件下，沙漠栽培品種比地中海生態(tài)型保持更高的 RWC（圖 1F）。此外，植物的累積增重與累積蒸騰作用之間的比率（圖 1G）表明，沙漠生態(tài)型的 WUE 高于地中海生態(tài)型，其中 WUE 計(jì)算為 RWC 與蒸騰速率 E（單向方差分析，p = 0.02）。為了鑒定反映對干旱脅迫的差異反應(yīng)的候選基因，在干旱處理的第 5 天對來自每個(gè)生態(tài)型的兩株植物的葉樣本進(jìn)行采樣以進(jìn)行 RNA 提取。

圖2. 組裝轉(zhuǎn)錄本和生態(tài)型間同源性概述

使用BLAST將所有PUT相互比較，以確定兩個(gè)不同的野生大麥生態(tài)型之間共享的同源PUT的比例。兩種不同的生態(tài)型共享來自兩種生態(tài)型的約 9,546 (29%) 個(gè)PUT或46%的B1K2 PUT（圖 2C）。 因此，大多數(shù)轉(zhuǎn)錄本僅限于兩種生態(tài)型之一。 生態(tài)型之間共享轉(zhuǎn)錄本的平均長度（B1K2 = 800 bp和B1K30=741 bp）顯著大于（p <0.001）生態(tài)型特異性轉(zhuǎn)錄本（B1K2 = 461 bp 和 B1K30 = 420 bp）。分享比例對于長度超過500和1,000 bp的轉(zhuǎn)錄本，PUT分別增加到69%和84%。這表明特定生態(tài)型的轉(zhuǎn)錄本較短，或者識(shí)別其他生態(tài)型中直系同源物的能力取決于轉(zhuǎn)錄本長度。

圖3. B1K基因與大麥基因相關(guān)性的對數(shù)圖

為了評(píng)估野生大麥轉(zhuǎn)錄組序列在改善栽培大麥基因組注釋方面的用途，通過使用 BLASTX預(yù)測*轉(zhuǎn)錄本覆蓋的編碼序列（CDS）的范圍來調(diào)查轉(zhuǎn)錄本*或部分覆蓋大麥HC基因的數(shù)量。62%的B1K PUTs標(biāo)記了45%的大麥HC基因，5%的與大麥HC基因同源的B1K PUTs*覆蓋了HC基因。大多數(shù)較短的HC基因（即小于 1500 bp）被PUT很好地覆蓋，而較長的HC基因覆蓋則較少（圖3A和3B）。較長的HC基因比較短的HC基因比例更高，這與野生大麥的產(chǎn)量有關(guān)（圖3B）。此外，我們使用OrfPredictor來預(yù)測CDS。來自所有三個(gè)組件的超過 99% 的*轉(zhuǎn)錄本包含長度超過33個(gè)核苷酸的CDS，平均預(yù)測CDS長度為350 bp (B1K)；19%的長度超過500 bp，4%的長度超過1 kb。3.3% (584) 來自 B1K PUT 的預(yù)測CDS與它們的直系同源HC CDS具有相同的CDS長度，而2.6%（456）的CDS長度大于其同源體。（圖3C）。