【方法解讀】DNA甲基化的檢測方法

時間：2023-3-22 閱讀：367

一、DNA甲基化概述
表觀遺傳學是研究DNA序列不發生改變的前提下，基因的表達發生可遺傳變化的一門學科。表觀遺傳修飾的研究內容包含DNA甲基化、組蛋白甲基化、組蛋白乙酰化、ADP-核糖基化等。DNA甲基化是人類最早發現的表觀遺傳修飾之一，屬于非組蛋白表觀遺傳現象。DNA甲基化是指在DNA甲基轉移酶（DNA Methyltransferase, DNMTs）的催化下，將一個甲基（CH3）基團共價連接到胞嘧啶的5號碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶（5mC）的過程。哺乳動物體細胞的DNA甲基化主要發生在CpG島（CpG islands，C指胞嘧啶，G指鳥嘌呤，p指連接CG堿基的磷酸）。研究結果表明，基因調控元件（如啟動子）的CpG島發生5mC修飾會在空間上阻礙轉錄因子復合物與DNA的結合。因而DNA甲基化一般與基因沉默相關，非甲基化一般與基因的活化相關，而去甲基化一般與沉默基因的重新激活相關。
細胞的表觀遺傳修飾與細胞代謝、癌癥、衰老、心血管疾病及神經退行性疾病等多種疾病相關。受環境，疾病，性別和年齡等因素影響，DNA甲基化水平處于動態的變化過程。不同個體、組織與細胞之間，甚至是同一個體或細胞的不同發育時期，DNA甲基化的程度和狀態都可能存在差異。研究表明，DNA甲基化在基因調控、蛋白質表達、胚胎發育、細胞分化、X染色體失活以及疾病和腫瘤的發生、發展等過程中起重要的調節作用。

二、DNA甲基化的常見檢測方法
DNA甲基化具有重要的生物學功能，科學家們開發了大量的方法檢測DNA甲基化水平。
目前常見的DNA甲基化測定方法包括以下幾類：
1. 基因組甲基化水平的分析方法：包括高效液相色譜（HPLC）和高效毛細管電泳法（HPCE）。
2. 候選基因甲基化分析方法：包括甲基化敏感性限制性內切酶-PCR/Southern法（MSRE-PCR/Southern）、重亞硫酸鹽測序法（Bisulphite Sequencing）、甲基化特異性的PCR（MS-PCR）、甲基化熒光法、焦磷酸測序（Pyrosequencing）、以及結合重亞硫酸鹽的限制性內切酶法（COBRA）等。
3. 基因組范圍的DNA甲基化模式與甲基化譜方法：包括限制性標記基因組掃描（RLGS）、甲基化間區位點擴增（AIMS）、甲基化CpG 島擴增（MCA）、差異甲基化雜交（DMH）、由連接子介導PCR出的HpaII小片段富集分析、以及甲基化DNA免疫沉淀法等。

三、使用微孔板讀板機測定DNA甲基化
1. DNA甲基化檢測
DNA甲基轉移酶催化甲基基團共價連接到胞嘧啶的5號碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶（5mC），5mC是最早被發現，也是研究最多的修飾堿基，在基因表達調控、生物生長發育和疾病發生等過程中發揮重要作用。5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）是在哺乳動物胚胎干細胞和人、小鼠腦細胞中表達的一種修飾，它可以把胞嘧啶羥甲基化。DNA 甲基化水平是一個DNA 甲基化和DNA 去甲基化的動態調控的過程。研究結果表明，5mC可以導致基因沉默或基因表達水平降低，而5hmC作為去甲基化過程的第一步，會導致基因激活或基因表達水平升高。分析5mC和5hmC在不同細胞和基因組不同區域的含量和比例，對于確認健康和疾病的細胞/組織中的甲基化修飾變化具有重要意義。高效液相色譜法（HPLC）, 薄層色譜法（TLC）和質譜等基于層析的技術都可以被用來檢測5mC和5hmC，但是它們步驟復雜，耗時，且成本較高。

利用微孔板讀板機（酶標儀）進行DNA甲基化相關實驗測定靈敏度高，特異性好，并且整個操作步驟簡易，快速。可以利用Molecular Devices酶標儀，結合DNA甲基化檢測分析試劑盒，通過光吸收法或熒光法定量檢測不同樣本的甲基化DNA（5mC）和羥甲基化DNA（5hmC）。

2. DNA甲基轉移酶檢測
DNA甲基化是表觀遺傳學的重要部分，DNA甲基化模式的改變會導致腫瘤及多種疾病的發生，例如在很多腫瘤中都發現DNA甲基轉移酶（DNMTs）的表達異常。對DNA甲基轉移酶的研究不僅可以揭示DNA甲基化對基因表達調控的機制，對腫瘤等疾病的治療也具有潛在意義。

作為甲硫氨酸的活性形式，s-腺苷甲硫氨酸（s-adenosyl-methionine，SAM）在生物體內的各種代謝過程中起重要作用，參與催化人體內多種不同甲基轉移酶，并且與多種甲基轉移酶的活性密切相關。SAM作為甲基供體，在甲基轉移酶的催化作用下，可以將甲基基團轉移到相應底物上，隨后生成s-腺苷高半胱氨酸（s-adenosyl-l-homocysteine，SAH）。甲基轉移酶通用酶活評價分析方法就是利用這一特性，通過檢測SAH的含量變化，從而評估催發反應中甲基轉移酶的活力和反應效率等。
Elisa作為傳統的方法，存在實驗步驟多，需要經過多次洗板、加樣、顯色等操作步驟，耗時長，結果不穩定等不足。可以利用Molecular Devices酶標儀，結合均相時間分辨熒光（Homogeneous Time-Resolved Fluorescence，HTRF）的方法檢測甲基轉移酶，這種檢測方法適合幾乎所有甲基轉移酶和底物的檢測，操作步驟簡單、靈敏度高且無放射性污染。