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【前沿?zé)狳c(diǎn)】石榴的腸道菌群代謝產(chǎn)物可提高免疫系統(tǒng)抗癌能力
近期，德國(guó)Georg-Speyer-Haus腫瘤生物學(xué)和實(shí)驗(yàn)治療研究所的研究人員在免疫學(xué)領(lǐng)域dingji期刊《Immunity》上發(fā)表了題為“Expansion of T memory stem cells with superior anti-tumor immunity by Urolithin A-induced mitophagy”的研究論文。抗腫瘤免疫會(huì)受到T細(xì)胞持久性和抗原呈遞減少的限制。Denk等人發(fā)現(xiàn)，石榴提取物的天然代謝物尿石素A（Urolithin A）可以增強(qiáng)腫瘤中的抗原呈遞，促進(jìn)CD8+ T細(xì)胞的自噬，從而產(chǎn)生具有增強(qiáng)抗腫瘤特性的再生干細(xì)胞樣記憶細(xì)胞（TSCM）。 
圖4
圖5
圖6
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
UA以T細(xì)胞依賴性的方式抑制腸腫瘤生長(zhǎng)
為了研究UA依賴性自噬是否模仿了Stat3△IEC小鼠的效果，并以T細(xì)胞依賴性的方式阻止了腸道腫瘤的發(fā)展，研究者們采用了氧化偶氮甲烷 （AOM）誘導(dǎo)的腫瘤發(fā)生模型。FVB小鼠每周注射一次致癌物AOM，持續(xù)6周，并以含UA的飼料（2.28 g/kg）或?qū)φ诊暳衔桂B(yǎng)18周（圖1A）。口服UA可顯著降低腫瘤發(fā)生率和腫瘤大小（圖1B-1D）。隨之而來(lái)的是CD3+ T細(xì)胞浸潤(rùn)到結(jié)腸黏膜的增多（圖1E和1F）。結(jié)合腫瘤類器官APTK 類器官 （characterized by loss of Apc, Trp53, and Tgfbr2 as well as expression of oncogenic KrasG12D）系統(tǒng)實(shí)驗(yàn) ，證實(shí)了UA誘導(dǎo)的腫瘤抑制依賴于T細(xì)胞。
UA以T細(xì)胞依賴性的方式抑制腸腫瘤生長(zhǎng)
為了研究UA依賴性自噬是否模仿了Stat3△IEC小鼠的效果，并以T細(xì)胞依賴性的方式阻止了腸道腫瘤的發(fā)展，研究者們采用了氧化偶氮甲烷 （AOM）誘導(dǎo)的腫瘤發(fā)生模型。FVB小鼠每周注射一次致癌物AOM，持續(xù)6周，并以含UA的飼料（2.28 g/kg）或?qū)φ诊暳衔桂B(yǎng)18周（圖1A）。口服UA可顯著降低腫瘤發(fā)生率和腫瘤大小（圖1B-1D）。隨之而來(lái)的是CD3+ T細(xì)胞浸潤(rùn)到結(jié)腸黏膜的增多（圖1E和1F）。結(jié)合腫瘤類器官APTK 類器官 （characterized by loss of Apc, Trp53, and Tgfbr2 as well as expression of oncogenic KrasG12D）系統(tǒng)實(shí)驗(yàn) ，證實(shí)了UA誘導(dǎo)的腫瘤抑制依賴于T細(xì)胞。
圖1
UA促進(jìn)TSCM分化
線粒體重塑與T細(xì)胞命運(yùn)的改變有關(guān)。考慮到UA效應(yīng)對(duì)CD8+ T細(xì)胞的依賴性，研究者們想了解UA是否也可能直接影響T細(xì)胞的命運(yùn)。從FVB小鼠中純化的T細(xì)胞被αCD3/αCD28珠刺激，誘導(dǎo)T細(xì)胞分化為效應(yīng)T細(xì)胞亞群，無(wú)論UA存在與否，持續(xù)72小時(shí)。UA給藥阻斷了向效應(yīng)T細(xì)胞的分化（圖2B和2C），并導(dǎo)致幼稚CD44loCD62Lhi T細(xì)胞顯著增加。此外，還觀察到中樞記憶細(xì)胞（TCM）的減少，而效應(yīng)記憶細(xì)胞（TEM）的頻率保持不變。在CD4+細(xì)胞中，只觀察到較晚時(shí)間點(diǎn)的變化，其特征是CD4+細(xì)胞的幼稚樣減少，但TEM細(xì)胞的頻率增強(qiáng)。
線粒體重塑與T細(xì)胞命運(yùn)的改變有關(guān)。考慮到UA效應(yīng)對(duì)CD8+ T細(xì)胞的依賴性，研究者們想了解UA是否也可能直接影響T細(xì)胞的命運(yùn)。從FVB小鼠中純化的T細(xì)胞被αCD3/αCD28珠刺激，誘導(dǎo)T細(xì)胞分化為效應(yīng)T細(xì)胞亞群，無(wú)論UA存在與否，持續(xù)72小時(shí)。UA給藥阻斷了向效應(yīng)T細(xì)胞的分化（圖2B和2C），并導(dǎo)致幼稚CD44loCD62Lhi T細(xì)胞顯著增加。此外，還觀察到中樞記憶細(xì)胞（TCM）的減少，而效應(yīng)記憶細(xì)胞（TEM）的頻率保持不變。在CD4+細(xì)胞中，只觀察到較晚時(shí)間點(diǎn)的變化，其特征是CD4+細(xì)胞的幼稚樣減少，但TEM細(xì)胞的頻率增強(qiáng)。
UA通過(guò)過(guò)繼T細(xì)胞轉(zhuǎn)移改善腫瘤治療
研究者們從OT-1供體小鼠（圖3A）中培養(yǎng)T細(xì)胞48小時(shí)（UA或?qū)φ眨缓筮^(guò)繼轉(zhuǎn)移到免疫缺陷Rag1-/-小鼠。移植后7天，在接受了UA處理的T細(xì)胞的小鼠中，移植的CD8+ T細(xì)胞的數(shù)量更高（圖3B），支持增加的擴(kuò)張潛力。此外，當(dāng)UA條件下的OT-1 T細(xì)胞移植到具有可觸及的過(guò)表達(dá)卵白蛋白APTK （APTK- ova）腫瘤的小鼠（圖3C），這導(dǎo)致了與對(duì)照OT-I T細(xì)胞相比更強(qiáng)的腫瘤抑制（圖3D和3E）。對(duì)腫瘤的分析顯示，在UA-T細(xì)胞轉(zhuǎn)移后，腫瘤中CD44表達(dá)較低，而TCF1HiCD8+腫瘤浸潤(rùn)T細(xì)胞數(shù)量較高（圖3F和3G）。這在腫瘤中符合UA誘導(dǎo)的記憶表型的維持。CD62L表達(dá)保持不變（圖3H）。此外，與改善的記憶反應(yīng)一致，接受UA預(yù)處理的T細(xì)胞的動(dòng)物在TME中包含更少的Tim3HiPD1Hi最終耗盡的CD8+ T細(xì)胞（圖3I）。因此，UA在過(guò)繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程中增強(qiáng)了免疫介導(dǎo)的抗腫瘤記憶。UA誘導(dǎo)T細(xì)胞的Pink1依賴性自噬
研究者們進(jìn)一步證實(shí)，在給CD8+ T細(xì)胞服用UA后6小時(shí)內(nèi)，線粒體膜電位降低（圖4A和4B）。這伴隨著增強(qiáng)的溶酶體形成（圖4C）， 24小時(shí)后，線粒體含量以劑量依賴性的方式丟失（圖4D）。后者可以在所有分析的T細(xì)胞亞群中檢測(cè)到，因此提示有絲分裂的誘導(dǎo)。圖4的其他數(shù)據(jù)也有力地支持了UA誘導(dǎo)的依賴于Pink1的自噬觸發(fā)TSCM的形成以增強(qiáng)抗腫瘤免疫的觀點(diǎn)。
研究者們進(jìn)一步證實(shí)，在給CD8+ T細(xì)胞服用UA后6小時(shí)內(nèi)，線粒體膜電位降低（圖4A和4B）。這伴隨著增強(qiáng)的溶酶體形成（圖4C）， 24小時(shí)后，線粒體含量以劑量依賴性的方式丟失（圖4D）。后者可以在所有分析的T細(xì)胞亞群中檢測(cè)到，因此提示有絲分裂的誘導(dǎo)。圖4的其他數(shù)據(jù)也有力地支持了UA誘導(dǎo)的依賴于Pink1的自噬觸發(fā)TSCM的形成以增強(qiáng)抗腫瘤免疫的觀點(diǎn)。
圖4
UA通過(guò)Pgam5胞質(zhì)釋放驅(qū)動(dòng)Wnt信號(hào)誘導(dǎo)TSCM
研究者們共鑒定出1178個(gè)差異表達(dá)基因，其中765個(gè)表達(dá)上調(diào)，413個(gè)表達(dá)下調(diào)（圖5A）。UA治療降低了免疫檢查點(diǎn)和效應(yīng)分子編碼基因的表達(dá)，而增強(qiáng)了Cd27、Ccr7和粘附基因的表達(dá)（圖5B），這是干細(xì)胞樣CD8+ T細(xì)胞的一個(gè)特征。另外，研究了觀察到的TCF1上調(diào)是否是Wnt信號(hào)增強(qiáng)的結(jié)果。根據(jù)這一概念，觀察到幾個(gè)Wnt靶基因的轉(zhuǎn)錄增加（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4B）。此外，UA在6小時(shí)后已經(jīng)導(dǎo)致β-連環(huán)蛋白磷酸化顯著下降（圖5），表明Wnt信號(hào)的激活早于轉(zhuǎn)錄因子的改變。圖其他結(jié)果表明UA通過(guò)Wnt依賴的PGC-1a上調(diào)來(lái)驅(qū)動(dòng)TSCM的形成，這是由Pgam5在自噬反應(yīng)中的囊內(nèi)釋放所促進(jìn)的。
圖5
UA促進(jìn)人TSCM細(xì)胞，幫助產(chǎn)生有效的CAR - TSCM
最后，研究者們希望確定UA是否會(huì)導(dǎo)致人類CD8+ T細(xì)胞中TSCM細(xì)胞的擴(kuò)增。從健康獻(xiàn)血者的外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）中分離出人CD3+ T細(xì)胞，并在UA存在的情況下體外用αCD3/αCD28珠刺激它們。事實(shí)上，在5 / 5個(gè)人供體中，UA增加了基于CD45RA+CCR7HiCD62L+CD95+CD8+表達(dá)的人類TSCM細(xì)胞的頻率（圖6B;圖S5A和S5B）。與小鼠T細(xì)胞一樣，UA處理48小時(shí)后，人CD8+ T細(xì)胞顯示出線粒體膜電位下降（圖6C），細(xì)胞內(nèi)染色證實(shí)TCF1表達(dá)增加（圖6D），證實(shí)UA誘導(dǎo)小鼠和人T細(xì)胞的記憶干細(xì)胞特征。為了確定UA引發(fā)的自噬是否也構(gòu)成了誘導(dǎo)CAR-TSCM的可行策略，在存在或不存在UA的情況下，激活的T細(xì)胞通過(guò)慢病毒載體（VSV-LV）轉(zhuǎn)導(dǎo)CD19-CAR基因。轉(zhuǎn)導(dǎo)后3天，測(cè)定CAR -表達(dá)TSCM的數(shù)量（圖6E）。UA不影響基因傳遞到CD8+細(xì)胞；然而，盡管在UA暴露后，CAR-表達(dá)的TSCM細(xì)胞顯著增加，約占CD8+細(xì)胞的60%（圖6F），但這對(duì)CD19 CAR- T細(xì)胞介導(dǎo)的NALM-6白血病細(xì)胞殺傷沒有負(fù)面影響（圖6G）。即使將UA應(yīng)用于先前冷凍的癌胚抗原特異性CAR - T細(xì)胞（CEA;圖6H），這種強(qiáng)烈增強(qiáng)的CAR - TSCM形成（圖6I）與表達(dá)CEA的人類CRC類器官的殺傷效果相當(dāng)（圖6J）。因此，UA顯著增強(qiáng)CAR-TSCM細(xì)胞的增殖。在CAR T 細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)中，采用了Molecular Devices 公司的SpectraMax iD3酶標(biāo)儀的發(fā)光模式進(jìn)行了數(shù)據(jù)讀取。
最后，研究者們希望確定UA是否會(huì)導(dǎo)致人類CD8+ T細(xì)胞中TSCM細(xì)胞的擴(kuò)增。從健康獻(xiàn)血者的外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）中分離出人CD3+ T細(xì)胞，并在UA存在的情況下體外用αCD3/αCD28珠刺激它們。事實(shí)上，在5 / 5個(gè)人供體中，UA增加了基于CD45RA+CCR7HiCD62L+CD95+CD8+表達(dá)的人類TSCM細(xì)胞的頻率（圖6B;圖S5A和S5B）。與小鼠T細(xì)胞一樣，UA處理48小時(shí)后，人CD8+ T細(xì)胞顯示出線粒體膜電位下降（圖6C），細(xì)胞內(nèi)染色證實(shí)TCF1表達(dá)增加（圖6D），證實(shí)UA誘導(dǎo)小鼠和人T細(xì)胞的記憶干細(xì)胞特征。為了確定UA引發(fā)的自噬是否也構(gòu)成了誘導(dǎo)CAR-TSCM的可行策略，在存在或不存在UA的情況下，激活的T細(xì)胞通過(guò)慢病毒載體（VSV-LV）轉(zhuǎn)導(dǎo)CD19-CAR基因。轉(zhuǎn)導(dǎo)后3天，測(cè)定CAR -表達(dá)TSCM的數(shù)量（圖6E）。UA不影響基因傳遞到CD8+細(xì)胞；然而，盡管在UA暴露后，CAR-表達(dá)的TSCM細(xì)胞顯著增加，約占CD8+細(xì)胞的60%（圖6F），但這對(duì)CD19 CAR- T細(xì)胞介導(dǎo)的NALM-6白血病細(xì)胞殺傷沒有負(fù)面影響（圖6G）。即使將UA應(yīng)用于先前冷凍的癌胚抗原特異性CAR - T細(xì)胞（CEA;圖6H），這種強(qiáng)烈增強(qiáng)的CAR - TSCM形成（圖6I）與表達(dá)CEA的人類CRC類器官的殺傷效果相當(dāng)（圖6J）。因此，UA顯著增強(qiáng)CAR-TSCM細(xì)胞的增殖。在CAR T 細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)中，采用了Molecular Devices 公司的SpectraMax iD3酶標(biāo)儀的發(fā)光模式進(jìn)行了數(shù)據(jù)讀取。
圖6
總結(jié)
T記憶干細(xì)胞（TSCM）表現(xiàn)出增強(qiáng)的自我更新能力和延長(zhǎng)的生存能力，從而防止T細(xì)胞衰竭，促進(jìn)有效的抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)。TSCM細(xì)胞可以被尿石素A （UA）擴(kuò)增。 （UA）是由腸道微生物群系從富含鞣花丹寧的食物中產(chǎn)生的，已被證明可以改善線粒體健康狀態(tài)。口服UA給荷瘤小鼠提供了強(qiáng)大的抗腫瘤CD8+ T細(xì)胞免疫，而體外UA預(yù)處理的T細(xì)胞在過(guò)繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移后顯示出更好的抗腫瘤功能。UA誘導(dǎo)的TSCM的形成依賴于Pink1介導(dǎo)的自噬觸發(fā)線粒體磷酸酶Pgam5的胞質(zhì)釋放。胞質(zhì)Pgam5去磷酸化β-catenin，驅(qū)動(dòng)Wnt信號(hào)通路和代償性線粒體生物發(fā)生。總的來(lái)說(shuō)，研究者們揭示了一個(gè)連接自噬和TSCM形成的關(guān)鍵信號(hào)通路，并認(rèn)為耐受性良好的代謝化合物UA是改善免疫治療的一個(gè)有吸引力的選擇。
T記憶干細(xì)胞（TSCM）表現(xiàn)出增強(qiáng)的自我更新能力和延長(zhǎng)的生存能力，從而防止T細(xì)胞衰竭，促進(jìn)有效的抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)。TSCM細(xì)胞可以被尿石素A （UA）擴(kuò)增。 （UA）是由腸道微生物群系從富含鞣花丹寧的食物中產(chǎn)生的，已被證明可以改善線粒體健康狀態(tài)。口服UA給荷瘤小鼠提供了強(qiáng)大的抗腫瘤CD8+ T細(xì)胞免疫，而體外UA預(yù)處理的T細(xì)胞在過(guò)繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移后顯示出更好的抗腫瘤功能。UA誘導(dǎo)的TSCM的形成依賴于Pink1介導(dǎo)的自噬觸發(fā)線粒體磷酸酶Pgam5的胞質(zhì)釋放。胞質(zhì)Pgam5去磷酸化β-catenin，驅(qū)動(dòng)Wnt信號(hào)通路和代償性線粒體生物發(fā)生。總的來(lái)說(shuō)，研究者們揭示了一個(gè)連接自噬和TSCM形成的關(guān)鍵信號(hào)通路，并認(rèn)為耐受性良好的代謝化合物UA是改善免疫治療的一個(gè)有吸引力的選擇。