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免疫共沉淀Co-IP是研究蛋白間相互作用的經(jīng)典方法，其以抗體和抗原間的專一性作用為基礎(chǔ)，通過偶聯(lián)beads的Protein A/G與A蛋白及抗體復(fù)合物結(jié)合，進(jìn)而將潛在的與A蛋白互作的B蛋白也沉淀下來。一般后續(xù)再對(duì)拿到的免疫復(fù)合物進(jìn)行WB分析驗(yàn)證。
 

免疫共沉淀Co-IP本身的操作流程并不復(fù)雜，麻煩的是相關(guān)的操作步驟需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)實(shí)際情況進(jìn)行優(yōu)化。辛辛苦苦忙活了好一陣子，你拿到的Co-IP結(jié)果很可能是這樣的。
 

免疫共沉淀Co-IP的高背景和抗體污染（IgG交叉反應(yīng)）問題相當(dāng)令人頭疼，以下是小愛整理給到您的優(yōu)化建議：
 

1）針對(duì)非特異性作用的高背景

細(xì)胞裂解物中存在大量蛋白質(zhì)，可能會(huì)在操作過程中發(fā)生與目標(biāo)復(fù)合物的非特異性結(jié)合。這些非特異性相互作用一般通過*清洗beads結(jié)合的免疫復(fù)合物來清除，但也可以應(yīng)用其他策略來優(yōu)化非特異性結(jié)合，例如：

▲ 通過將鹽濃度從120mM滴定至1000mM來改變緩沖液的離子強(qiáng)度；

▲ 減少一抗的使用量，直到信號(hào)干擾比；

▲ 參考我們推薦的操作步驟，進(jìn)行細(xì)胞裂解物預(yù)清除。
 

2）針對(duì)抗體污染（IgG交叉反應(yīng)）

免疫共沉淀Co-IP抗體污染問題是在WB分析中來自IP抗體IgG條帶的干擾（IP抗體與WB抗體同源時(shí)發(fā)生），IgG的輕重鏈在25kD和50kD左右，并且在SDS-PAGE中可能會(huì)有<5kD的偏移。針對(duì)這種情況可以采用以下幾種方法進(jìn)行優(yōu)化：

▲ IP和WB采用不同來源抗體，IP為鼠源則WB可以選用兔抗；

▲ 采用特異性識(shí)別IgG輕鏈或者重鏈的二抗，如目的蛋白與IgG輕鏈接近、則可采用重鏈二抗；

▲ 運(yùn)用交聯(lián)劑將IP抗體和Protein A/G -Beads交聯(lián)，通過添加不含巰基乙醇的加樣緩沖液處理目的蛋白-抗體- Protein A/G-beads復(fù)合物，后離心去除復(fù)合物，上清中只留下目的蛋白；

▲ WB分析前，可以考慮采用低pH洗脫來代替煮沸，低pH值（2-3）可以降低抗原/抗體相互作用、從而將抗原和抗體分離（如1M甘氨酸緩沖液，pH 2-3），注意電泳前需平衡pH；

▲ 將常用的融合標(biāo)簽（如GFP）摻入用于Co-IP主要靶蛋白中，選用優(yōu)質(zhì)特異性的抗融合標(biāo)簽抗體，有需要時(shí)還可將該抗體預(yù)固定以用于蛋白復(fù)合物純化。
 

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