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色譜柱固定相鍵合方式及修飾方法有哪些？
日常工作中，經常遇到老師咨詢硅膠單體表面的硅烷鍵合方式，是單鍵鍵合、雙鍵鍵合還是三鍵鍵和呢？填料表面是否有活性硅醇基，有沒有封端？碳鏈上是否嵌入極性官能團，是哪種官能團？在有些項目標準上，要求固定相是堿基失活硅膠。熟悉固定相鍵合方式及其修飾，有助于了解色譜柱的使用條件，選擇合適的色譜柱。
制備反相色譜柱填料常用的方法是有機硅烷和硅膠表面的硅醇基上發生共價反應，來“鍵合"生成固定相或者配合基R：
X3-Si-R+≡Si-OH→≡Si-O-Si（X2）-R+HX
（硅烷）（硅烷醇）（最后的固定相）
HPLC柱子的制備可通過幾種不同的硅烷-硅膠反應來實現。單體相是反相柱子里使用zui廣泛的技術，即一個硅烷分子和硅醇基反應。這種一對一鍵合，使生成的鍵合相相對完善并且具有很好的重現性。這樣制作的填料通常會具有zui高的柱效，因為固定相層相對不擁擠，因此溶質分子能夠快速擴散進出固定相。相反，多官能團的、高度聚合的固定相則表現出較低的溶質擴散速度和較低的柱效，尤其是在流動相流速較高的情況下。
01 鍵合方式
目前單體的硅烷-硅膠鍵合技術主要分為四種：單鍵鍵合（Ultimate® XB-C18）、雙鍵鍵合（Sunfire C18）、三鍵鍵合（Ultimate® PAH）、雙齒鍵合（ZORBAX Extend C18）。單鍵鍵合有利于提高傳質速率，加快色譜柱平衡，但在低pH條件下長期使用時，單鍵鍵合相易流失，在色譜圖上表現為保留時間縮短。而使用多鍵鍵合的方式（雙鍵鍵合、三鍵鍵合和雙齒鍵合）可以提高固定相在低pH條件下的穩定性。
02 硅膠封端
因為存在結構位阻，硅膠表面的硅醇基無法wan全與硅烷分子鍵合，而殘留的硅醇基，可能與堿性化合物發生次級離子交換作用，導致峰形不佳，因此常采用體積較小的TMS（如三甲基硅烷）或者其他技術封端，使填料表面盡可能的減小殘留硅醇基。但是TMS在pH較低時容易被水解和破壞，這會造成保留時間和選擇性發生改變。另一方面來說，封端填料提高了色譜柱在堿性條件下的穩定性，降低柱流失，并有利于色譜柱對極性和堿性化合物的分離、提供良好的峰形。
03 空間位阻保護-側鏈烷基
在硅膠表面的十八烷基的側鏈上引入甲基、異丙基或異丁基，可以極大程度的屏蔽硅膠表面硅醇基的作用。空間保護對于低pH的分離實驗非常有幫助，避免了低pH條件下O-Si鍵的斷裂，但不能用在高pH條件下。具有空間保護功能的固定相可以以多種配合基的形式存在（比如，C8、C18、氰基、苯基），每個配合基在流動相較低的pH條件下均能保持較高的穩定性（pH低至0.8）。常見該類型色譜柱如月旭Ultimate® LP系列色譜柱。
04嵌入極性基團
一般反相色譜柱對強極性和強堿性物質分離較差，在反相固定相的碳鏈中嵌入極性基團（如脲基、酰胺基、醚基或甲酸酯基），提高對此類物質的選擇性，同時極性基團屏蔽了硅膠表面的硅醇基作用，可極大改善峰形，在測定堿性物質時不拖尾。典型代表如采用酰胺基團的Ultimate® Polar-RP色譜柱。
另外碳鏈中存在極性基團，能使固定相的親水性濕潤性增強，用到95%以上的高水流動相時，不會發生相塌陷。具有與普通的反相C18和C8柱不同的選擇性，特別是對于酚類等極性物質。