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Co柱常見問題及解決方案
在水溶液中，過渡金屬離子（如Zn2+、Cu2+、Ni2+和Co2+）與組氨酸和半胱氨酸間具有親和作用，IMAC正是以此親和力為基礎(chǔ)。將此方法延伸應(yīng)用，使金屬離子“強固定"于載體達到蛋白質(zhì)分級分離的目的。
應(yīng)根據(jù)具體應(yīng)用目的選擇固定于IMAC配基的金屬離子。三價陽離子，如Al3+、Ga3+和Fe3+或四價Zr4+更適合捕獲磷酸化蛋白質(zhì)和磷酸化肽，二價Cu2+、Ni2+、Zn2+和Co2+常用于純化His標記蛋白質(zhì)。聯(lián)合使用四配位配基，可以確保固定化牢固，而且金屬離子（Ni2+、Co2+）保留兩個自由配位鍵與生物高分子相互作用時，接受能力更高，同時回收率和洗脫蛋白質(zhì)純度無明顯變化。
月旭金屬螯合親和介質(zhì)主推Ni（NTA/IDA）、Co（NTA），今天主要介紹下Co Tanrose 6FF（NTA）的基本參數(shù)與常見問題。
Co Tanrose 6FF （NTA）
Co Tanrose 6FF（NTA）是以高度交聯(lián)的6%瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，氨三乙酸偶聯(lián)于瓊脂糖而成，之后螯合Co2+。鈷NTA瓊脂糖凝膠FF特異性好，螯合鈷更穩(wěn)定，不易脫落，能耐受更高的還原劑，物理和化學(xué)穩(wěn)定性好。
產(chǎn)品參數(shù)
柱子反壓高
原因分析：
1、填料被堵塞
解決方案：①裂解液中含有微小的固體顆粒，建議上柱前使用濾膜（0.22或0.45μm）過濾，或者離心去除。
②樣品中含有高濃度的核酸，加長破碎時間直至粘度降低，或者添加DNase I（終濃度5μg/ml），Mg2+（終濃度1mM），冰上孵育10-15分鐘。
2、樣品太粘稠
解決方案：有機溶劑或者蛋白穩(wěn)定試劑（如甘油等）可能會引起反壓增高，降低操作流速。
No.2
洗脫組分中沒有目的蛋白
原因分析：
1、蛋白可能是包涵體，不在上清中
解決方案：可以通過電泳檢測裂解液分析上清中是否含有目的蛋白，包涵體蛋白需要按照包涵體蛋白的純化方式。
2、表達量太低
解決方案：優(yōu)化表達條件。
3、目的蛋白結(jié)合比較弱，在洗雜步驟被洗下來了
解決方案：提高Wash Buffer的pH，或者降低咪唑濃度。
4、目的蛋白結(jié)合過強，不容易洗脫下來
解決方案：降低Elution Buffer的pH值，或者增加Elution Buffer中咪唑濃度。
5、蛋白降解
解決方案：菌體破碎時添加一些蛋白酶抑制劑。在4°C下進行純化操作。
No.3
洗脫組分不純（含有多種蛋白）
原因分析：
1、洗雜不*
解決方案：增加Wash Buffer體積。
2、樣品中含有其他的組氨酸標簽蛋白
解決方案：通過調(diào)節(jié)pH值，或者咪唑濃度來優(yōu)化洗雜條件。再使用其他的純化手段（如離子交換、疏水等）進一步純化洗脫組分。
No.4
填料呈現(xiàn)褐色
原因分析：
緩沖液中含有DTT等還原劑
解決方案：適當降低還原劑DTT的濃度，或者改用巰基乙醇。
No.5
上樣過程中蛋白發(fā)生沉淀
原因分析：
1、操作溫度太低
解決方案：室溫下進行上樣。
2、蛋白發(fā)生聚集
解決方案：在樣品和所有的緩沖液中添加穩(wěn)定劑，如0.1%的TritonX-100或者Tween-20。
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