Hieff NGS® eTAPS酶法DNA甲基化轉(zhuǎn)化試劑盒

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

Hieff NGS^® eTAPS Enzymatics Methyl-seq Conversion Module是翌圣生物科技（上海）股份有限公司開發(fā)的一款高效DNA甲基化位點(diǎn)轉(zhuǎn)化試劑盒（eTAPS技術(shù)），可以將甲基化的胞嘧啶（5mC）特異性地轉(zhuǎn)化成尿|嘧|啶（U）。最終，eTAPS技術(shù)可以高效特異性地將甲基化的胞嘧啶（5mC）轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶（T），通過C>T突變來實(shí)現(xiàn)單堿基分辨率和高準(zhǔn)確性的DNA甲基化正向篩選和鑒定，適用于1-200 ng起始量的DNA樣本。本試劑盒流程包括eTET酶氧化、轉(zhuǎn)化劑轉(zhuǎn)化和磁珠回收三個(gè)步驟，具有轉(zhuǎn)化效率高、操作簡(jiǎn)便、特異性好、回收率高等優(yōu)點(diǎn)。

產(chǎn)品組分

運(yùn)輸與保存方法

干冰運(yùn)輸。效期一年。-20℃保存，切不可搞錯(cuò)！

注意事項(xiàng)

一、 關(guān)于操作

1. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

2. 請(qǐng)于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數(shù)次充分混勻，短暫離心后置于冰上待用。

3. 推薦在帶熱蓋的PCR儀中進(jìn)行各步驟反應(yīng)，使用前應(yīng)預(yù)熱PCR儀至反應(yīng)溫度附近。

4. PCR產(chǎn)物因操作不當(dāng)極容易產(chǎn)生氣溶膠污染，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性。推薦將PCR反應(yīng)體系配制區(qū)和PCR產(chǎn)物純化檢測(cè)區(qū)進(jìn)行強(qiáng)制性的物理隔離；配備文庫(kù)構(gòu)建專用移液器等設(shè)備；定時(shí)對(duì)各實(shí)驗(yàn)區(qū)域進(jìn)行清潔（推薦使用ThermoFisher公司的DNAZap^TM高效核酸去除噴霧），以保證實(shí)驗(yàn)環(huán)境的潔凈度。

5. 本產(chǎn)品僅用作科研用途！

二、應(yīng)用范圍

本試劑盒適用于DNA甲基化（DNA 5mC）研究，針對(duì)的DNA投入量為1-200 ng，也提供了應(yīng)用于RNA 甲基化（RNA 5mC）的可能性。

三、關(guān)于DNA材料

1. 請(qǐng)不要用包含EDTA的緩沖液溶解DNA材料。若溶解DNA的緩沖液中包含EDTA，我們推薦先進(jìn)行NGS建庫(kù)，在PCR擴(kuò)增前再使用本試劑盒進(jìn)行DNA甲基化轉(zhuǎn)化。

四、關(guān)于試劑和操作注意事項(xiàng)

1. eTET1為二價(jià)金屬依賴性DNA雙加氧酶，因此對(duì)氧化體系中EDTA較為敏感。請(qǐng)不要用包含EDTA的緩沖液溶解DNA材料。若使用EDTA的緩沖液溶解DNA材料，我們建議進(jìn)行一輪DNA回收進(jìn)行純化，或者對(duì)eTET1 Enhancer的投入量進(jìn)行重新滴定，以達(dá)到eTET1最佳的氧化效果。對(duì)于DNA NGS建庫(kù)，若起始DNA溶解液較為復(fù)雜，建議先進(jìn)行DNA建庫(kù)步驟（如DNA|片段化、末端修復(fù)、接頭連接和磁珠回收），使用ddH2O溶解回收的DNA，再使用本試劑盒對(duì)DNA進(jìn)行eTAPS轉(zhuǎn)化，最后進(jìn)行文庫(kù)擴(kuò)增。

2. eTET1 Enhancer容易被氧化，收到后建議分裝保存于-20℃。短時(shí)間內(nèi)不用，建議-80℃保存。

3. Conversion Enhancer有輕微揮發(fā)性和刺激性，使用時(shí)請(qǐng)保證操作環(huán)境通風(fēng)，并戴好口罩和防護(hù)眼鏡。

4. Neutralizer具有強(qiáng)堿性，在使用過程中請(qǐng)做好防護(hù)。滴到皮膚上，應(yīng)先用干凈布拭去，然后用大量水清洗，最后涂抹稀硼酸稀溶液。滴到實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，用濕抹布擦去即可。

5. 2 × HiFi Uracil Plus PCR Mix是耐尿|嘧|啶的超高保真DNA聚合酶反應(yīng)液，主要用于eTAPS轉(zhuǎn)化后DNA的擴(kuò)增。在NGS建庫(kù)過程中，請(qǐng)用此酶代替建庫(kù)試劑盒中的擴(kuò)增mix，以保證更高效的文庫(kù)擴(kuò)增和保真性。若使用轉(zhuǎn)座酶法建庫(kù)，則無須進(jìn)行擴(kuò)增mix的替換。

五、關(guān)于DNA甲基化標(biāo)準(zhǔn)品

Specific Methylated Site DNA使用的是一段人工合成的DNA|片段，片段上包含三個(gè)DNA甲基化位點(diǎn)，兩個(gè)甲基化位點(diǎn)主要用于評(píng)判eTAPS的轉(zhuǎn)化效率。序列如下(下劃線堿基C即為甲基化的C)：

AGTGACGCATGATCTGTACGATCGACCGTGCAACCCGACGCATGATCTGTACTGATCGACCGTGCAACAGCAGTCTCGATCAGCTGCTCCGCATGCAAGTAGCGGTACTAACGTACAGTACGATGCTAGCTAGTGCTTAGGATCGAGATCGCAGAAGGGCAAGCATTAGCTATCGATCGAGCACTACTAGCTAGCATCCGATCGATCATCGTCACGGTACGTCCAGC。

Specific Methylated Site DNA的濃度為100 pg/μL，在使用過程中請(qǐng)根據(jù)自身DNA投入量進(jìn)行添加。我們推薦的投入DNA和Specific Methylated Site DNA比例為100-1000:1。

六、自備材料

1. DNA回收：我們推薦使用Hieff NGS^® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)進(jìn)行DNA回收，也可以使用柱回收和

AMPure^® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)進(jìn)行代替。

2. DNA建庫(kù)試劑盒：我們推薦使用以下DNA建庫(kù)試劑盒進(jìn)行illumina或者MGI文庫(kù)的構(gòu)建：

全能型DNA建庫(kù)試劑盒(Yeasen Cat#12199、12200、12201、13310)

一步法DNA建庫(kù)試劑盒(Yeasen Cat#12203、12204、12205、13321、13322)

單鏈DNA建庫(kù)試劑盒(Yeasen Cat#12211)

3. 其他材料：無水乙醇、無菌超純水、低吸附槍頭、PCR管、磁力架、PCR儀、恒溫震蕩儀等。

使用方法

一、操作流程

圖1.eTAPS酶法DNA甲基化轉(zhuǎn)化試劑盒原理示意圖和建庫(kù)操作流程

二、操作步驟（操作前請(qǐng)仔細(xì)閱讀操作注意事項(xiàng)）

2.1 eTET1酶處理

1. 將表1中試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用（eTET1 Enhancer解凍混勻后放置在冰上）。

2. 于無菌PCR管中配制表1所示反應(yīng)體系。

表1 eTET1氧化反應(yīng)體系

3. 37℃反應(yīng)1.5 h。加入1 μL Termination Buffer和1 μL Termination Enzyme。（若為了更好的轉(zhuǎn)化效果，此處可以將PCR管放在PCR儀中50 ℃處理 10 min）。

2.2 轉(zhuǎn)化劑處理

1. 將表2中試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。

2. 于無菌PCR管中配制表2所示反應(yīng)體系。

表2 轉(zhuǎn)化劑處理反應(yīng)體系

【注】：Conversion Enhancer和Reagent需要單獨(dú)添加，請(qǐng)不要提前混成mix。

3. 37℃反應(yīng)14-18 h（混勻后可以在PCR儀中反應(yīng)，熱蓋50℃）。

4. 反應(yīng)結(jié)束后，加入22 μl Neutralizer，混勻。

2.3 磁珠回收

1. 加入120 μL室溫下平衡的DNA Selection Beads，渦旋混勻或移液器吹打10次混勻，室溫靜置孵育10-15 min。

2. 短暫離心（<100×g），將離心管置于磁力架上靜置3 min，待磁珠*貼壁后吸除PCR管中溶液。保持PCR管始終處于磁力架中，從另一側(cè)加入200 μL 80％乙醇，避免直接沖刷磁珠，靜置60 s。吸除液體，保持PCR管始終處于磁力架中，再次加入200 μL 80％乙醇，靜置60 s。吸除干凈液體，保持PCR管始終處于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（不超過3 min）。從磁力架上取下PCR管，加入21 μL ddH2O，并充分渦旋。室溫靜置5 min。

3. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體。待溶液澄清后（約5 min），小心轉(zhuǎn)移20 μL上清至干凈的管中，于-20℃保存。

2.4 DNA建庫(kù)

按照推薦的試劑盒說明書進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。我們推薦使用以下DNA建庫(kù)試劑盒進(jìn)行illumina或者M(jìn)GI文庫(kù)的構(gòu)建：

全能型DNA建庫(kù)試劑盒(Yeasen Cat#12199、12200、12201、13310)

一步法DNA建庫(kù)試劑盒(Yeasen Cat#12203、12204、12205、13321、13322)

轉(zhuǎn)座酶DNA建庫(kù)試劑盒（Yeasen Cat#12206、12207）

單鏈DNA建庫(kù)試劑盒(Yeasen Cat#12211)

【注】2 × HiFi Uracil Plus PCR Mix是耐尿|嘧|啶的超高保真DNA聚合酶反應(yīng)液，主要用于eTAPS轉(zhuǎn)化后DNA的擴(kuò)增。在NGS建庫(kù)過程中，請(qǐng)用此酶代替建庫(kù)試劑盒中的擴(kuò)增mix，以保證更高效的文庫(kù)擴(kuò)增和保真性。

HB211029