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產品簡介
| 供貨周期 | 現貨 | 應用領域 | 醫療衛生,生物產業 |
|---|
產品介紹
產品描述
本產品適用于多重PCR實驗。4×Multiplex PCR Master Mix for Pathogen以熱啟動多重Taq酶制劑與4×擴增緩沖液為組分配置成預混液。本預混液可快速便捷地用于多重PCR反應，擴增子GC含量25-75%范圍內可以有效擴增。具備高均一性、高特異性和高靈敏度的特點，同時嚴控背景菌。本試劑可兼容30~100對以內不同大小片段的多重擴增，也可用于進行數千重及以上擴增子的捕獲。可應用病原微生物檢測、環境微生物鑒定、食品安全檢測等多個應用場景。
運輸與保存方式
冰袋運輸。-25 ~ -15℃儲存，有效期2年。
實驗流程
推薦反應體系：
一輪反應體系
組分 | 體積（μL） | 終濃度 |
4×Hieff® Multiplex PCR Master Mix for Pathogen | 7.5 | 1× |
Primer mix | x | 0.02 μM-0.5 μM |
模板DNA | x | 1 ng-400 ng |
無菌超純水 | x | - |
總體積 | To30 |
【注】
1上表中DNA量和引物濃度均為推薦用量和濃度，可根據具體實驗情況進行調整最適濃度。
2）參考建議：每條引物的濃度可在0.02 μM-0.5 μM范圍內進行調整。
3）預混液中已經包含擴增所需要的酶、dNTP、鹽離子等，無需額外添加。
二輪反應體系
組分 | 體積（μL） | 終濃度 |
2×Hieff® Multiplex PCR Master Mix for Pathogen（Cat.13581） | 15 | 1× |
Primer Index mix | 4（~6 pmol） | |
一輪純化產物 | 11 | |
無菌超純水 | x | - |
總體積 | To 30 |
推薦反應程序：
循環步驟 | 溫度（℃） | 時間 | 循環數 |
預變性 | 95℃ | 3 min | 1 |
變性 | 95℃ | 30 sec | X |
退火 | 60℃ | 30 sec | |
延伸 | 72℃ | 30 sec | |
終延伸 | 72℃ | 3 min | |
暫存 | 4℃ | - | 1 |
【注】
退火時間可以根據Panel種類不同，進行適當延長，或者是梯度退火，比如64℃ 1 min，60℃ 1 min;
延伸時間以最長片段為準。延伸時間太長會導致非特異性擴增增多，可通過縮短延伸時間來提高擴增特異性，延伸時間不少于30 sec。
針對模板含量較低的樣本，可通過增加循環數提高擴增產出。
Panel引物重數較多時可增加退火時間，調整梯度退火程序，或者根據已有Panel的合適的PCR反應程序進行測試。
循環數推薦：
單管引物重數 | 推薦循環數 （10 ng gDNA ） | 退火延伸時間 | |
一輪 | 二輪 | ||
10-50 | 10~28 | 18~28 | 30 s~2 min |
50-200 | 10~28 | 16~28 | 30 s~2 min |
200-800 | 10~28 | 14~28 | 30 s~2 min |
800以上 | 10~28 | 12~28 | 30 s~4 min |
【注】
上表是基于10 ng gDNA進行的一輪及二輪循環數的推薦；當投入量大于10 ng，二輪的相應的循環數可以減少；當投入量小于10 ng，一，二輪的相應的循環數要相應的增加。
多重擴增引物純化
一輪 PCR 產物 0.9×磁珠純化
1) 準備工作：將 Hieff NGS® DNA Selection Beads 磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少 30 min。 配制 80%乙醇。
2) 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。
3) 吸取 27 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads（0.9×，Beads:DNA=0.9:1）至一輪 PCR 產物中，室溫孵育 5 min。
4) 將 PCR 管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約 5 min），小心移除上清。
5) 保持 PCR 管始終置于磁力架中，加入 200 μL 新鮮配制的 80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育 30 sec 后，小心移除上清。
6) 重復步驟 5，總計漂洗兩次。
7) 保持 PCR 管始終置于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現龜裂（不超過 5min）。
8) 直接加入 11 μL ddH2O，將 PCR 管從磁力架中取出，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置 5 min。進入下一步反應。
二輪 PCR 產物 0.9×磁珠純化
1) 準備工作：將 Hieff NGS® DNA Selection Beads 磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少 30 min。 配制 80%乙醇。
2) 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。
3) 吸取 27 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads（0.9×，Beads:DNA=0.9:1）至一輪 PCR 產物中，室溫孵育 5 min。
4) 將 PCR 管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約 5 min），小心移除上清。
5) 保持 PCR 管始終置于磁力架中，加入 200 μL 新鮮配制的 80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育 30 sec 后，小心移除上清。
6) 重復步驟 5，總計漂洗兩次。
7) 磁珠晾干后，將PCR管從磁力架上取下，加入30 μL Nuclease-free ddH2O覆蓋磁珠，使用移液器吹打混勻。室溫孵育2 min。如果磁珠干燥開裂，適當延長孵育時間。
8）將PCR管短暫離心收集后置于磁力架中，分離磁珠和液體直到溶液澄清(約5 min)。 小心吸取25 μL上清轉移至新的EP管中，繼續進行下一步反應。
