聯系電話
翌圣生物科技（上海）股份有限公司
初級會員·12年
- 聯系人：
- 曹女士
- 電話：
- 400-6111-883
- 手機：
- 售后：
- 4006-111-883
- 傳真：
- 86-21-34615995
- 地址：
- 上海市浦東新區天雄路166弄1號3樓
- 網址：
- www.yeasen.com
掃一掃訪問手機商鋪
產品簡介
| 供貨周期 | 現貨 | 規格 | 16 T |
|---|---|---|---|
| 貨號 | 13342ES16 | 應用領域 | 醫療衛生,化工,生物產業 |
產品介紹
產品信息
產品名稱 | 產品編號 | 規格 | 價格（元） |
Hieff NGS® Universal Library Convert Kit/NGS文庫轉換試劑盒 | 13342ES16 | 16 T | 1165 |
13342ES96 | 96 T | 5835 |
產品描述
該試劑盒可以將Illumina試劑盒構建的雙鏈線性文庫轉化為兼容華大智造測序平臺的環狀ssDNA文庫。構建的文庫可使用BGISEQ-500RS、 MGISEQ-200RS 和 MGISEQ-2000RS 進行測序。
產品組分
組分編號與名稱 | 13342ES16 | 13342ES96 | ||
13342-A |
| AC-PCR Amplification mix | 400 μL | 2×1200 μL |
13342-B |
| AC-PCR Primer mix | 16 μL | 96 μL |
13342-C |
| App-A Splint Buffer | 240 μL | 2×720 μL |
13342-D |
| Ligase | 80 μL | 480 μL |
13342-E |
| Digestion Buffer | 130 μL | 780 μL |
13342-F |
| Digestion Enzyme | 32 μL | 192 μL |
運輸與保存方法
干冰運輸。
所有組分-20°C保存，有效期1年。
*當運輸條件、儲存條件及使用方式都正確時，所有組分在有效期內均能保持完整活性。
注意事項
一、關于操作
1. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
2. 請于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數次充分混勻，短暫離心后置于冰上待用。
3. 配制各步驟反應液時推薦使用移液器吹打混勻或輕輕振蕩，劇烈振蕩可能會造成文庫產出下降。
4. 為避免樣品交叉污染，推薦使用帶濾芯的槍頭，吸取不同樣品時請更換槍頭。
5. 推薦在帶熱蓋的PCR儀中進行各步驟反應，使用前應預熱PCR儀至反應溫度附近。
6. 定時對各實驗區域進行清潔（使用0.5%次氯酸鈉或10%漂白劑進行擦拭清理），以保證實驗環境的潔凈度。
7. 本產品僅作科研用途！
二、樣本要求及處理
2.1樣本要求
樣本為線性dsDNA文庫，接頭序列符合下列之一：
單index：
5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-Insert-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-[i7]-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'
雙index：
5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5]ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-insert-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-[i7]-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'
線性dsDNA文庫插入片段范圍為 100 ~ 500 bp，同時主帶集中在±100 bp 以內。
2.2 樣本量要求
根據文庫總量選擇合適的線性dsDNA投入量，詳見表1：
表1 線性dsDNA總量與濃度要求
線性dsDNA文庫投入量(ng) | 線性dsDNA文庫總量(ng) | 線性dsDNA文庫濃度要求(ng/μl) |
10 | ≤25 | ＞0.45 |
25 | 25＜文庫總量＜50 | 1＜文庫濃度＜2.1 |
50 | ＞50 | ＞2.1 |
2.3 轉換PCR
不同線性 dsDNA 文庫投入量，所需 PCR 循環也不相同，詳見表2：
表2 不同線性dsDNA投入量PCR循環數推薦表
線性dsDNA文庫投入量(ng) | 推薦PCR循環數 |
10 | 8 |
25 | 7 |
50 | 6 |
2.4 轉換文庫pooling要求
1. 不推薦在轉換PCR前對線性dsDNA進行pooling。
2. 需將接頭轉換 PCR 產物混合測序，則 Sample Barcode Pooling 應遵循堿基平衡的原則：最佳平衡狀態 ATGC 4種堿基的占比應分別為 25% ，若不能達到 25%，則要保證每個 cycle 都存在 ATGC 四種堿基序列，并且最少的堿基不應低于 12.5%，最多的堿基不應高于 62.5%。
3. 不同片段長度的文庫不建議 pooling 環化。
4. 若樣本所需數據量相同且長度相同，則可以等量混合，每個樣本所需的質量按照公式1進行計算：
公式1混合樣本中單個樣本所需質量的計算
單個樣本所需的質量 (ng)=1 pmol Input DNA 對應的質量 (ng）/混合的樣本個數 N
5. 混合后接頭轉換 PCR 產物總量為 1 pmol，總體積最多為 40 μL；若文庫不足則用 TE buffer補充至 40 μL
三、關于磁珠純化（Bead-based Clean Up）
1. 磁珠使用前應先平衡至室溫，否則會導致純化得率下降。
2. 磁珠每次使用前都應充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。
3. 磁珠漂洗使用的80%乙醇應現用現配，否則將影響回收效率。
4. 產物洗脫前應將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無水乙醇殘留影響后續反應；過分干燥又會導致磁珠開裂進而降低純化得率。通常情況下，室溫干燥約5 min。
5. 單鏈環產物純化保存，可使用TE Buffer洗脫，產物可于-20°C可保存1個月。
四、關于文庫質檢（Library Quality Analysis）
1. 轉換文庫推薦使用 Qubit® dsDNA HS Assay Kit 或 Quant-iTTM PicoGreen® dsDNA Assay Kit 等雙鏈 DNA 進行定量， 要求最終接頭轉換 PCR產物的摩爾產量至少為 1 pmol，可根據公式2計算或參考表2。
公式2 PCR 產物摩爾數與質量間的換算
1 pmol PCR 產物對應的質量 (ng)=DNA 主片段大小 (bp)×0.66
表3 不同片段大小PCR產物1 pmol對應產量
PCR產物主片段大小（bp） | 1 pmol對應產量（ng） |
300 | 198 |
350 | 231 |
400 | 264 |
450 | 297 |
500 | 330 |
2. 單鏈環產物純化后推薦使用 Qubit® ssDNA Assay Kit 單鏈 DNA 熒光染料試劑對純化后產物進行定量。
3. 單鏈環狀 DNA 產物純化后產量應達到 60 fmol 以上方足夠一次上機測序的量，可根據公式3計算或參考表3 。
公式 3 單鏈環摩爾數與質量間的換算
60 fmol 單鏈環對應的質量 (ng)=0.06×DNA 主片段大小 (bp)×0.33
PCR產物主片段大小（bp） | 60 fmol對應產量（ng） |
300 | 5.94 |
350 | 6.93 |
400 | 7.92 |
450 | 8.91 |
500 | 9.90 |
使用方法
一、自備材料
1. 純化磁珠：Cat#12601，Hieff NGS® DNA Selection Beads或Cat#A63880，AMPure XP Beads或其他等效產品。
2. 文庫質控：Cat#12640，dsDNA HS Assay Kit for Qubit®或Cat#12642，1×dsDNA HS Assay kit for Qubit®或其他等效產品。
3. 單鏈環質控：Cat # Q10212, Thermo fisher Qubit® ssDNA Assay Kit或其他等效產品。
3. 其他材料：無水乙醇、滅菌超純水、TE Buffer（10 mM Tris-HCl，pH 8.0-8.5+0.1 mM EDTA）、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR儀等。
二、操作流程
圖1 通用文庫轉換流程
三、操作步驟
Part A接頭轉換PCR
1.轉換PCR
該步驟對線性dsDNA文庫進行轉換-轉化為可以進行后續環化的線性dsDNA文庫。
將表5中試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。
于無菌PCR管中配制表5所示反應體系。
表5 轉換PCR擴增反應體系
名稱 | 體積（μL） |
AC-PCR Amplification Mix | 25 |
AC-PCR Primer Mix | 1 |
線性dsDNA 文庫 | |
ddH2O | |
Total | 50 |
3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應液收集至管底。
4. 將PCR管置于PCR儀中，設置表6所示反應程序，進行PCR擴增。
表6 PCR擴增反應程序
溫度 | 時間 | 循環數 |
98°C | 1 min | 1 |
98°C | 10 sec | 參照注意事項中表2 |
60°C | 30 sec | |
72°C | 30 sec | |
72°C | 5 min | 1 |
4°C | Hold | - |
2、轉換PCR產物純化
1. 準備工作：將Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。
2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。
3. 吸取45 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads（0.9×，Beads : DNA=0.9:1）至Adapter Ligation產物中，室溫孵育5 min。
4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。
5. 保持PCR管始終置于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec后，小心移除上清。
6. 重復步驟5，總計漂洗兩次。
7. 保持PCR管始終置于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現龜裂（不超過5 min）。
8. 將PCR管從磁力架中取出，進行洗脫：加入32 μL TE buffer，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min。
9. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體。待溶液澄清后（約5 min），小心轉移30 μL上清至干凈的管中。
3、轉換PCR產物質檢
使用 Qubit® dsDNA HS Assay Kit 等轉換PCR產物進行定量，具體請參見注意事項四。
Part B 轉換文庫環化
1 變性
1. 根據文庫長度，取1 pmol 至 0.2 ml PCR 管中，用 TE Buffer 補充至總體積 40 μL。
4. 混勻后，在 PCR 儀上進行 98℃變性 3 min，之后立即置于冰上，冰浴 2 min 后瞬時離心。
2 單鏈環化
1. 將表7中各試劑解凍后，顛倒混勻，置于冰上備用。
2. 于冰上配制表7反應體系。
表7 單鏈環化體系
名稱 | 體積（μL） |
上一步反應物 | 40 |
App-A Splint Buffer | 15 |
Ligase | 5 |
Total | 60 |
3.使用移液器輕輕吹打或低速振蕩混勻，并短暫離心將反應液離心至管底。
4. 將PCR管置于PCR儀上，按照表8所示攝制反應程序，進行單鏈環化反應。
表8 單鏈環化反應程序
溫度 | 時間 |
熱蓋105°C | OFF |
37°C | 15 min |
4°C | Hold |
3 酶切消化
1. 將表9中各試劑解凍后，顛倒混勻，置于冰上備用。
2. 于冰上配制表9所示反應體系。
表9 酶切消化體系
名稱 | 體積（μL） |
上一步反應物 | 60 |
Digestion Buffer | 8 |
Digestion Enzyme | 2 |
Total | 70 |
3. 使用移液器輕輕吹打或低速振蕩混勻，并短暫離心將反應液離心至管底。
4. 將PCR管置于PCR儀上，按照表10的條件進行反應：
表10 酶切消化反應程序
溫度 | 時間 |
熱蓋105°C | OFF |
37°C | 10 min |
4°C | Hold |
5. 反應結束后，瞬時離心，立即進行純化。
4 消化產物純化
該步驟使用磁珠對3.3步驟的產物進行純化。
1. 準備工作：將Hieff NGS® DNA Selection Beads或 Beckman AMPure XP Beads由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。
2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。
3. 吸取120 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads至消化產物中，室溫孵育10min。
4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約2 min），小心移除上清。
5. 保持PCR管始終置于磁力架中，加入500μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec后，小心移除上清。
6. 重復步驟5，總計漂洗兩次。
7. 保持PCR管始終置于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現龜裂。
8. 將PCR管從磁力架中取出，加入22 μL TE Buffer，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置10 min。
9. 短暫離心，將 PCR 管始終置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約 2min），將上清小心移至新 PCR 管中， -20℃保存，待制備 DNB。
5 消化產物質控
使用Qubit® ssDNA Assay Kit熒光試劑對酶切消化產物進行定量，具體請參見注意事項四。
HB220117
