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4，洗脫方式的選擇,
離子交換色譜洗脫方式有三種：一是改變緩沖液pH，使蛋白質從吸附狀態變為解吸附狀態。如在陰離子交換色譜中，通過降低流動相pH使吸附在柱子上的帶負電荷的蛋白質帶正電，從而達到解吸附，在陽離子交換色譜中則是通過升高流動相pH的方法達到解吸附；二是增加緩沖液的離子強度，將吸附強的分子從離子交換劑上替換下來；三是緩沖液pH和離子強度同時改變。無論哪一種方法，都可用階段洗脫和梯度洗脫兩種方式進行。
階段洗脫是用幾個不同pH緩沖液或幾個不同鹽濃度的緩沖液逐步進行洗脫。即pH和離子強度變化不連續。而在梯度洗脫中，緩沖液的洗脫能力是連續增加的，由于后者分辨率更好，因此被廣泛采用。
在經典色譜中需用梯度混合器來制造線性梯度，梯度混合器是由兩個容器構成，兩個容器安放在同一個水平上，一個盛起始緩沖液，另一個盛含較高離子強度或不同pH的緩沖液。二者用管子相連，以保持溶液的流體靜力平衡。當緩沖液從*個容器流入柱內，第二個容器的緩沖液進入*個容器自動補足，使緩沖液形成梯度。
現在許多中低壓色譜儀器（如Waters，Pharmacia等公司的一些產品）和液相色譜一樣可以用計算機控制雙泵自動配制流動相，很容易地獲得直線或非直線、連續或非連續的梯度模式，以滿足不同的分離需要。
通常對線性梯度的要求是：
（1）洗脫液的總體積應足夠大，一般梯度至少要四倍床體積，使分離的各個峰有較好的分辨率；
（2）梯度上限要有足夠強的洗脫能力，使吸附的zui緊密的物質也能夠從柱子上被洗脫下來；
（3）梯度的斜率不應太大，以確保各峰能夠分開，但又不應太小，以免峰形過寬甚至形成拖尾；一般認為，梯度體積越大，梯度變化越緩，則分辨率越好。
（1）洗脫液的總體積應足夠大，一般梯度至少要四倍床體積，使分離的各個峰有較好的分辨率；
（2）梯度上限要有足夠強的洗脫能力，使吸附的zui緊密的物質也能夠從柱子上被洗脫下來；
（3）梯度的斜率不應太大，以確保各峰能夠分開，但又不應太小，以免峰形過寬甚至形成拖尾；一般認為，梯度體積越大，梯度變化越緩，則分辨率越好。
實驗操作
1．填料的預處理
2．裝柱
離子交換色譜不同于凝膠色譜，柱子通常較為短小，對于一般工作，通常選長度為10-40cm的柱已足夠。柱的直徑按照欲分物質的數量來選定。對于很復雜的混合物和進行精細分析是用細長的柱，分辨率較好；對于初步分離可用較粗、容量較大的柱。裝好的柱子用起始緩沖液充分平衡后上樣。
3．上樣
離子交換色譜柱必須充分平衡后方可上樣。上樣量取決于色譜柱的交換容量，一般為交換容量的70-80%，上樣體積可以不受限制。通常低濃度樣品上樣可達床體積的幾倍到幾百倍。這一點對較稀的樣品極為有利，可以同時起到分離和濃縮的雙重作用，可謂一舉兩得。但用于分析時，為了提高分辨率，上樣量體積適當減小。用于離子交換色譜分離的樣品溶液的離子強度和pH值必須與起始緩沖液（即流動相A液）一致，如不一致，應進行緩沖液轉換，可通過透析或凝膠色譜來完成。
4．洗脫、樣品收集
加樣后用足夠量的起始緩沖液洗滌除去不吸附的物質，然后再進行洗脫。洗脫可選擇不同的方法，用控制器或梯度混合器控制梯度。流出的樣品組分經紫外檢測器實時檢測（檢測波長一般為280nm），用分部收集器或手工收集。
5．再生
樣品洗脫完畢后要進行再生，以除去仍然結合在柱子上未*洗下的一些蛋白質，通常用100%流動相B液再洗脫1個柱體積即可。
6. 平衡
再生后的柱子欲再次進樣需重新進行平衡，平衡一般用100%A液（即0%B液）洗滌柱子至少四個柱體積。
7．保存
柱子不用時應用強洗脫劑洗去結合于柱子上的雜質，然后再用蒸餾水*清洗后加抑菌劑保存。
