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（一）原 理

由于聚丙烯酰胺凝膠的濃度可以按要求配制，因此可以形成“連續系統”和“不連續系統”兩種電泳系統。“不連續系統”zui大的特點在于大大提高了樣品分離的分辨率。這種電泳的主要特點是：（1）使用兩種不同濃度的凝膠系統；（2）配制兩種凝膠的緩沖溶液成分及pH不同，并且與電泳槽中電泳緩沖液的成分、pH也不相同。在實驗中，電泳凝膠分為兩層：上層膠為低濃度的大孔膠，稱為濃縮膠或成層膠，配制此層膠的緩沖液是Tris-HCl，pH6.7；下層膠則是高濃度的小孔膠，稱為分離膠或電泳膠，成膠的緩沖液是Tris-HCl，pH8.9。電泳槽中的電極緩沖液則是Tris-甘氨酸，pH8.3?？梢?，凝膠濃度、成膠成分、pH與電泳液緩沖系統各不相同，形成了一個不連續系統。

電泳時，蛋白質樣品放置在濃縮膠上，為防止蛋白質樣品在電極緩沖液中擴散，因而加入等體積的40%蔗糖或50%甘油與之混合，以提高密度；為觀察蛋白質樣品泳動的情況，樣品中還加入溴酚藍等示蹤染料，這些有色物質的分子比任何一種大分子物質泳動的速度都快，只要染料未泳動出凝膠管，樣品就沒有走出膠管的危險。

在不連續系統中，當接通電源開始電泳時，系統中的甘氨酸、蛋白質、HCl中的氯離子和溴酚藍等均解離為陰離子，形成離子流向陽極泳動。其遷移率取決于離子的電荷數、分子量大小及形狀。然而，當電極緩沖液（pH8.3）中的甘氨酸離子在進入濃縮膠時，它們遇到了比pH8.3低的pH（6.7），pH下降了近兩個單位，幾乎接近于甘氨酸的等電點（5.97），于是甘氨酸的解離度突然降低，所帶電荷量明顯減少，遷移率減慢。血清樣品中個蛋白質成分也進入濃縮膠，pH的改變雖對其解離度有影響，但比對甘氨酸要小得多，其遷移率比甘氨酸要大，而且濃縮膠的膠孔較大對蛋白質分子不會造成阻礙。濃縮膠中的Tris-HCl中的Cl-則全部解離，分子量很小，摩擦力不大，其遷移率比蛋白質、溴酚藍都快。于是在濃縮膠中各種離子的遷移率形成：甘氨酸<蛋白質<溴酚藍

甘氨酸分子進入濃縮膠后解離度的下降，造成移動離子流的突然缺失，出現電流減小電導率下降。然而，整個電泳系統中其他部分的電流仍維持不變，根據電導及電位梯度成反比（E=I/n，E為電位梯度，I為電流強度，n為電導率）的關系，于是在前導離子Cl-離子與慢離子甘氨酸離子之間突然形成了較高的局部電位梯度。處在這個局部高電位梯度區域中的血清蛋白質各成分，在高電場作用下迅速以不同的速度（分子量不同、帶電量不同）泳向前導Cl-離子區域。當到達前導Cl-區域時因不缺少離子，大的電場強度減弱，離子移動速度急速減慢下來，其結果在甘氨酸和Cl-離子之間的蛋白質樣品就按其分子的大小堆積或濃縮成層。通過這個過程，是蛋白質樣品濃縮了好幾百倍，且蛋白質各成分也按一定的順序排列成層。

當離子流繼續向前，進入以pH8.9緩沖液配制的小孔膠時，蛋白質分子在小孔膠里遇到阻力，遷移率減慢，同時在pH8.9條件下，甘氨酸又充分解離，其帶電量增加，消除了離子流缺失的現象，小分子的甘氨酸離子趕上了蛋白質。凝膠各部分恢復具有恒定的電場強度，蛋白質的分離*按一般區帶點用方式進行。

由以上的原理可見，聚丙烯酰胺凝膠的不連續電泳zui主要的優點就是使蛋白質樣品經濃縮膠后，形成緊密地壓縮層進入分離膠。蛋白質各成分預先分開且壓縮成層，可以減少在電泳時，成分間由于自由擴散而造成的區帶相互重疊所帶來的干擾，這樣就提高了電泳的分辨能力。由于這個優點，少量的蛋白質樣品（1-100??g）也能分離得很好，分辨率高使血清蛋白質可獲得近20多個區帶。

（二）試劑和器材

1．測試樣品 血清蛋白、脫鹽后的IgG、純化后的IgG。

2．試劑

（1）制備分離膠、濃縮膠有關試劑

① 凝膠緩沖液：稱取1mol/L HCl 48ml，Tris（三羥基氨基甲烷）36.6g，TEMED（N，N，N`，N`-四甲基乙二胺）0.23ml，加重蒸水至80ml使其溶解，調pH8.9，然后加重蒸餾水定容至100ml，置棕色瓶，4℃貯存。

② 分離膠貯液：28%Arc-0.735%Bis儲液：丙烯酰胺（Acr）28.0g，甲叉雙丙烯酰胺（Bis）0.735g，加重蒸水使其溶解后定容至100ml。過濾后置棕色試劑瓶中，4℃ 貯存，一般可放置1個月左右。

③ 分析純過硫酸胺（AP）（AR） 0.14g加重蒸水至100ml，置棕色瓶，4℃儲存僅能用一周，當天配制。上述3種試劑用于制備分離膠。

④ 濃縮膠緩沖液：稱取1mol/L HCl 48ml，Tris5.98g，TEMED 0.46ml，加重蒸水至80ml,調pH6.7，用重蒸水定容至100ml，置棕色瓶內，4℃貯存。

⑤ 濃縮膠貯液：稱Acr10g，Bis2.5g 加重蒸水溶解后定容至100ml，過濾后置棕色瓶內，4℃貯存。

⑥ 40%蔗糖溶液（W/V）

⑦核黃素溶液 核黃素4.0mg，加重蒸餾水溶解，定容至100ml，置棕色試劑瓶內，4℃貯存。

（2）Ph8.3 Tris-甘氨酸電極緩沖液

稱Tris6.0g，甘氨酸28.8g,加蒸餾水至900ml，調pH8.3后，用重蒸水定容至1000ml，置試劑瓶中，4℃貯存，臨用前稀釋10倍。

（3）0．1%溴酚藍指示劑

（4）染色液 染色液種類較多，染色方法也不*相同。本實驗采用0.05%考馬斯亮藍R250染色液中，含20%磺基水楊酸，其優點是染色、固定同時進行，背景易脫色。0.5%考馬斯亮藍R250的20%磺基水楊酸染色液：考馬斯亮藍0.05g，磺基水楊酸20g，加蒸餾水至100ml，過濾后置試劑瓶內保存。

（5）脫色液 7%乙酸溶液

（6）保存液 甘油10ml，冰乙酸7ml，加蒸餾水至100ml。

（7）1%瓊脂（糖）溶液   瓊脂（糖）1g，加已稀釋10倍的電極緩沖液，加熱溶解，4℃貯存，備用。

3．器材   電泳儀 夾心式垂直板電泳槽。

（三）操作方法

1．安裝夾心式垂直板電泳槽

夾心式垂直板電泳槽操作簡單，不易滲漏。這種電泳槽兩側為有機玻璃制成的電極槽，兩個電極槽中間夾有一個凝膠模，該模由一個上框形凝膠框、長與短玻璃板及樣品槽模板（梳子）所組成。電泳槽由上儲槽（白金電極在上或面對短玻璃板），下儲槽（白金電極在下或面對長玻璃板）和回紋狀冷凝管組成。兩個電極槽與凝膠模間靠儲液槽螺絲固定。各部間依下列順序組裝：

（1）將上儲槽和固定螺絲銷釘，仰放在桌面上。

（2）將上、短玻璃板分別插到上框形硅橡膠的凹形槽中。注意勿用手接觸灌膠面的玻璃。

（3）將已插好玻璃板的凝膠模平放在上儲槽上，短玻璃板應面對上儲槽。

（4）將下儲槽的銷孔對準已裝好螺絲銷釘的上儲槽 ，雙手以對角線的方式旋緊螺絲帽 。

（5）豎直電泳槽，在長玻璃板下端與硅膠模框交界的縫隙內加入已融化的1%瓊脂（糖）。其目的是封住空隙，凝固后的瓊脂（糖）中應避免有氣泡。

2．配膠

① 分離膠 20ml pH8.9 7.0 %PAA溶液中，凝膠緩沖液（pH8.9）2.5ml，分離膠貯液5.0ml，重蒸餾水2.5ml，充分混勻，抽氣10min，zui后加AP 10 ml。

② 濃縮膠 pH6.7 25% PAA：濃縮膠緩沖液∶濃縮膠貯液∶40%蔗糖溶液∶核黃素溶液按1∶2∶4∶1的比例混合。

3．制備凝膠板

不連續體系采用不同孔徑及pH的分離膠與濃縮膠 ，凝膠制備應分2步進行。

① 分離膠的制備：根據實驗要求，選擇zui終丙烯酰胺的濃度，本實驗需20ml pH8.9 7.0 %PAA溶液，其加膠方式不同于連續系統?；旌虾蟮哪z溶液，用細長頭的滴管加至長、短玻璃板間的窄縫內，加膠高度距樣品模板梳齒下緣約1cm。用1cm注射器在凝膠表面沿短玻璃板邊緣輕輕加一層重蒸水（約3-4mm）用于隔絕空氣，使膠面平整。為防止滲漏，在上、下儲槽中加入略低于膠面的蒸餾水。約30-60min凝膠*聚合，則可看到水與凝固的膠面有折射率不同的界線。用濾紙條吸去多余的水，但不要碰破膠面。如需預電泳，則上、下儲槽的蒸餾水倒去，換上分離膠緩沖液，10mA電流電泳1h，終止電泳后，棄去分離膠緩沖液，用注射器取濃縮膠緩沖液洗滌膠面數次，即可制備濃縮膠。

② 濃縮膠制備：濃縮膠為pH6.7 25% PAA，混合均勻后用細長的滴管將凝膠溶液加到長、短玻璃板的窄縫內（即分離膠上方），距短玻璃板上緣0.5cm處，輕輕加入樣品槽模板。在上、下儲槽中加入蒸餾水，但不能超過短玻璃板上緣。在距離電極槽10cm處，用日光燈或太陽照射，進行光聚合，但不要造成大的生溫。在正常情況下，照射6-7min，則凝膠由蛋黃透明變成乳白色，表明聚合作用開始。繼續光照30min，使凝膠聚合*。光聚和完成后放置30-60min，輕輕取出樣品槽模板，用窄條濾紙吸去樣品凹槽中多余的液體，加入稀釋10倍pH8.3的Tris-甘氨酸電極緩沖液。使液面沒過玻璃板約0.5cm，即可加樣。

4．加樣

作為分析用的PAGE加樣量僅需幾微克，2-3ul血清電泳后就能分出幾十條蛋白區帶。為防止樣品擴散，應在樣品中加入等體積40%蔗糖（內含少許溴酚蘭）。用微量注射器取5ul上述混合液，通過緩沖液，小心地將樣品加到凝膠凹形樣品槽底部，待所有凹形樣品槽內都加了樣品，即可開始電泳。

5．電泳

將直流穩壓電泳儀的正極與下槽連接，負極與上槽連接（方向切勿接錯）。接通冷卻水，打開電泳儀開關，開始時將電流調至10 mA 。待樣品進入分離膠時將電流調至20-30mA。當藍色染料遷移至距離橡膠框下緣1cm時，將電流調回到零，關電源及冷卻水。分別收集上、下貯槽電極緩沖液置試劑瓶中，4℃貯存還可用1-2次。旋松固定螺絲，取出硅橡膠框，用不銹鋼鏟輕輕將一塊玻璃板撬開移去，在膠板一端切除一角作為標記，將膠板移至大培養皿中染色。

6．固定，染色

本實驗采用0.05%考馬斯亮藍R250（內含20%磺基水楊酸）染色液，染色與固定同時進行，使染色液沒過膠板，染色30min左右。

7．脫色

用7%乙酸侵泡漂洗數次，直至背景藍色褪去。如用50℃水浴或褪色搖床，則可縮短褪色時間。脫色液經活性碳脫色后，可反復使用。

（四）注意事項

1．制備凝膠應選用高純度得試劑，否則會影響凝膠聚合與電泳效果。Acr及Bis是制備凝膠得關鍵試劑，如含有丙烯酸或其它雜質，則造成凝膠聚合時間延長，聚合不均勻或不聚合，應將它們分別純化后方能使用。Acr及Bis均為神經毒劑，對皮膚有刺激作用，實驗表明對小鼠得半致死量為170mg/kg，操作應在通風中進行。Acr的純化：稱70gArc溶于1000ml 50℃預熱的氯仿中，溶解后趁熱過濾。冷卻后，置-20℃低溫冰箱中，則有白色結晶析出，用預冷的布氏漏斗抽濾，收集白色結晶，再用預冷的氯仿淋洗幾次，真空干燥后置棕色瓶中密封儲存。Acr的熔點為84.5+0.3。純Acr水溶液pH應是，其pH值變化不大于0.4pH單位就能使用。Bis的純化：稱12gBis，使其溶于1000ml預熱40-50℃ 的丙酮中，趁熱過濾。冷卻后，置-20℃ 低溫冰箱中，待結晶析出后，用預冷的布氏漏斗抽濾，收集結晶，用預冷丙酮洗滌數次，真空干燥后置棕色瓶阿訇密封保存，Bis熔點為185℃。Acr和Bis的儲液在保存過程中，由于水解作用而形成丙烯酸和NH3，雖然溶液放在棕色試劑瓶中，4℃儲存能部分防止水解，但也只能儲存1-2個月，可測pH值（4.9-5.2）來檢查試劑是否失效。

2．由于與凝膠聚合有關的硅橡膠條、玻璃板表面不光滑潔凈，在電泳時會造成凝膠板與玻璃或硅橡膠條剝離，產生氣泡或滑膠；剝交時凝膠板易斷裂，為防止次現象，所以器材應嚴格地清洗。硅橡膠條的凹槽、樣品槽模板及電泳槽用泡抹海綿蘸取“洗潔凈”仔細清洗。玻璃板侵泡在重鉻酸鉀洗液3-4h或0.2mol/LKOH的酒精溶液中20min以上，用清水洗凈，再用泡沫海綿蘸取“洗潔凈”反復刷洗，zui后用蒸餾水沖洗，直接陰干或用乙醇沖洗后陰干。

3．安裝電泳槽和鑲有長、短玻璃的硅橡膠框時，位置要端正，均勻用力旋轉緊固定螺絲，以免緩沖液滲漏。樣品槽模板梳齒應平整光滑。

4．用瓊脂（糖）封底及灌凝膠時不能有氣泡，以免影響電泳時電流的通過。

5．凝膠*聚合后，必須放置30min-1h，使其充分“老化”后，才能輕輕取出樣品槽模板，切勿破壞加樣凹槽底部的平整，以免電泳區帶扭曲。

6．為防止電泳后區帶拖尾，樣品中鹽離子強度應盡量低，含鹽量高的樣品槽可用透析法或凝膠過濾法脫鹽。zui大加樣量不得超過100ug蛋白/100ul。

7．在不連續電泳體系中，預電泳只能在分離膠聚合后進行，洗凈膠面后才能制備膿縮膠。濃縮膠制備后， 不能進行預電泳，以充分利用濃縮膠的濃縮效應。

8．電泳時，電泳儀與電泳槽間正、負極不能接錯，以免樣品反方向泳動，電泳時應選用合適的電流、電壓、過高或過低均可影響電泳效果。

9．電泳后，應分別收集上下儲槽電極緩沖液，在冰箱儲存，可用2-3次。為保證電泳結果滿意，用新稀釋的緩沖液。