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做動物實驗,zui先要做的事情就是要養好動物。掌握好動物飼料、飲水及其生活環境,這對于動物實驗的成功是zui基本的保證。這是看似一個平常,但卻有著不少細節的問題。為了本版廣大站友能在整體上提高對實驗動物飼養的認識,做好動物實驗的*步,特此開設本貼討論動物飼養的問題。希望大家能踴躍參與,以更多的實例來充實、豐富本貼。
擬分以下幾個方面來討論:
實驗動物的選擇概述
實驗動物如何辨雌雄
實驗動物的適應性飼養
實驗動物的飼料(普通飼料、特殊飼料)
實驗動物的飲水
實驗動物的籠具
實驗動物的墊料
實驗動物的飼養環境
實驗動物的護理(造模后)
貼子中如有不當之處,請大家不吝指出!
*、實驗動物的選擇。
實驗動物如何選擇?這個問題對于藥理和實驗動物專業的朋友來說,不是難事。但對于需要做動物實驗的其它專業的朋友來說,有時候會感到茫然。或者沒有自己的思考,照抄別人的做法。對于這一部分站友,我們不可能要求去系統學習《醫學實驗動物學》,但我們可以常備一本在身邊。在需要用的時候翻一翻,將會使你豁然開朗。因為書中比較詳細地介紹了常用實驗動物的解剖生理、生物學習性等等,zui主要的是它為你選擇什么樣的實驗動物提供了重要的參考。
因此,系統學習或者零星地翻閱《醫學實驗動物學》是保證合理選用實驗動物的基礎之一。再者就是要參考大量文獻。在此,我不想對這一問題全面展開,只是提幾點原則和方法。
*,做什么樣的實驗?什么動物適合本實驗? 做什么實驗,這是選題時就確定好了的。肯定是經過論證的。無需多講。 用什么樣的動物呢?我想,大多是參照文獻,再結合自己對實驗動物的了解。選題之時就肯定閱讀過很多文獻了,因此不會陌生。如:做高血脂、動脈粥樣硬化,我想大多數人會選擇大鼠、兔子,也可以選金黃地鼠、鵪鶉,少數人會選小鼠,但我想用狗和猴的基本上不會有吧。因為要選擇比較容易形成此疾病的動物,且要易得。 所以,對于不太熟悉的人來說,要多看文獻,參考別人是如何選擇的。就算是對動物比較了解,系統學過這方面知識的,也要多看文獻,綜合權衡。切忌隨意地憑空想像。
第二,采取什么樣的方法造模? 做動物實驗通常是要造模的。選擇什么樣的方式?這要從實驗的目的及條件入手。造糖尿病,可以用手術,也可以用藥物。其中藥物有四氧嘧啶及鏈脲佐菌素(STZ)。后者用得較多,且為認同。而四氧嘧啶目前用得較少了。造模方法一是參照《藥理實驗方法學》,二是參照文獻。造模方法有時也決定了你的動物選擇。像做手術造動脈粥樣硬化,我想用大鼠比小鼠來得方便吧?
第三,經費承受能力如何? 做實驗也要精打細算。不可能為了所謂的高水平、技術而不顧實驗室的條件。像做高脂動物模型,假設經費只有一萬多元,一定要弄個敲除APoE基因的小鼠來做,恐怕沒人認同。做一個簡單的鎮痛抗炎實驗,你非得要用SPF實驗室,這也是不太實際的,也是沒必要的。就像一個剛剛能滿足溫飽的人突然要花上很多錢去國外旅游一樣,是不切實際的。因此,實驗經費讓我們有時不能達到理想的狀態。但是,科研并不一定是要用的技術、的動物,而是要能解決問題。能用簡單的技術、普通的動物解決問題的,就不必去盲目追求更高。過于理想化、不考慮經費問題,是不少研究生初涉實驗時的通病。
第四,多了解一下實驗中可能出現的問題。有不少人做實驗時根本沒有考慮可能出現的失誤,因而在實驗出現問題時茫然無措。即使是造同樣的疾病模型,不同的動物表現可能有不一樣的地方。要對這些問題有充分的了解,并要進行必要的預試。要了解動物的習性,并進行必要的護理。 因此,在你決定了選擇何種動物,以何種方式造模之后,實際上,你就要對整個實驗過程有全面的計劃,并對可能出現的問題有應對的措施。
第二、實驗動物如何辨雌雄?
這個問題應該是每個初涉動物實驗的人完*全掌握的,是不容許有任何一點差錯的。 如何辯?當然是看生殖器了。一般大動物好辯,像狗,猴等;小動物及中等大小的體型的難辨一點,如:小鼠、大鼠、兔。可有下列方法來鑒別:
1. 看肛門與生殖器之間的距離:雄性隔得遠,雌性隔得近。雄的生殖器與肛門間有陰囊,不過幼齡時不太明顯。
2. 雄性陰莖朝頭的方向突出,可輕輕擠壓包皮使其露出而確認。雌性較小時可見閉合的陰道口,擠壓亦可張開。像兔、豚鼠等,陰莖短小,故較難辨認。是擠壓生殖器以確認。看得熟練了,其實也不難。生殖器處呈O型者,為公的;生殖器處呈V型,下端裂縫延至肛門者,為母的。這主是針對幼齡的動物而言。
3. 看乳頭或睪丸。成年的動物比較好辯認。母的有乳頭,雄的有睪丸。但在比較小的時候,乳頭,睪丸并不是那么明顯的。
辨雌雄的目的就是為了分籠飼養,避免雌雄同籠而交配,無法進行實驗。不過,即使是同性的放在一籠,有些細節仍值得注意。 說一個小插曲:本人有一次將兩批做實驗剩下的小鼠弄到一個籠里。結果發現大的小鼠不斷追逐小的小鼠,且試圖交配。一師妹在旁說,是不是我弄了只雌的進去了?我仔細檢查了一下,根本沒有弄錯。放回去,過了一會兒又發現如此現象。后來我想可能是因為大的小鼠(25g~30g)已*性成熟,在找不到雌性的情況下來追小的雄性小鼠(15g~18g)以獲得性的滿足。這豈不成了“同性戀”?因此,動物的日齡相差太大的不要放在同一個籠里,以免發生上述現象。當然,一般而言,一個籠子養多個動物的主要是小鼠、大鼠、豚鼠、金黃地鼠等小動物,像兔子、狗一般都是一個籠子一只。 剛開始一定要認真仔細地觀察,這樣會有一些經驗。熟悉以后,可以很迅速很準確的分出來。對初學者而言,我建議用第2種方法予以確認。 一般提供商將動物送來時,都是已經分好了雌雄的。但我們仍要親自進行確認。一旦有一只混入異性群中,可能給實驗帶來極大的影響,甚至前功盡棄。
第2種方法的示意圖如下:(不僅是大、小鼠,也適合于兔、豚鼠等的性別鑒定)
第三 、 實驗動物的適應性飼養
所謂適應性喂養,是指實驗動物由繁殖地或供應商處搬到實驗動物房以后,在實驗之前,為了使之適應環境而喂養幾天的過程。這一過程非常重要,卻往往不受人重視。 這一過程一般至少為期三天,是一周。
為什么要進行適應性喂養?
1. 因為動物從一個地方進入到新的環境之后,它們要自行調整一下,才能適應。就像中國隊員到外國踢足球要倒時差一樣,動物們也要調節調節。因為運輸、轉移過程中,動物原有的自身節律受到了影響,需要恢復或適應新的節律。
2. 在適應性喂養期間可密切觀察動物是否健康?如果動物運來之時就帶有疾病,則可能在此期間表現出來。這讓我們對此有一個緩沖期。不至于拿有病的動物匆匆忙忙在做實驗。雖然不是所有有病的動物都在這幾天看得出來,但這幾天確實給了我們一個重要的參考。
怎樣使之適應?
1. 配置好飼料、飲水、墊料,做好通風,12h-12h明暗交替。努力使之在“新家”舒服地過好日子。
2. 密切觀察其毛發、排泄物、活動情況。這是考察動物是否有病的外在表現。
3. 注意與實驗室原有飼養的動物隔開一定的距離。其它動物的聲音、排泄的氨對新來的動物有一定的影響。 如發現動物有個別狀態不佳者,應立即隔離,并分析原因。有三分之一以上狀態不佳者,高度懷疑動物有疾病。有死亡者,高度懷疑此批動物有問題。
適應性喂養,是保證實驗成功的前提之一。在此期間發現動物有病者,應更換別的批次動物。也有的是實驗動物體重尚達不到實驗所要求的大小,這種情況下可適當延長適應性喂養的時間。
第四、實驗動物的飼料。
飼料是一個很重要的方面。我們要了解常用實驗動物基本的飼料組成。同時,也要了解造一些疾病模型所需的飼料組份(如:高脂模型,缺鐵性貧血模型等)。因此,下面分普通飼料和特殊飼料兩部分來講。
A 普通飼料
以常用的實驗動物為例,我們來討論一下它們飼料的組成。
一是小鼠、大鼠的飼料。以玉米、大豆、麩皮、魚粉為主,輔以復合維生素、骨粉、微量元素。一般做成長圓柱狀形。或曰粗棒形。直徑在1cm左右。這樣的飼料又稱為顆粒飼料(本人覺得此名稱不妥,是否可稱為“條狀飼料‘、“棒狀飼料”?)。顏色一般為大豆黃色。小鼠、大鼠的飼料為全價飼料,即不需要再添加任何營養成分。
二是豚鼠、兔子的飼料。以苜蓿、玉米、大豆、麩皮、魚粉為主,輔以復合維生素、骨粉、微量元素。與小鼠、大鼠的飼料相比,主要是苜蓿的比例達到了40%左右。一般做成細長圓柱形。或曰細棒形。直徑在0.3cm左右。顏色呈帶一點斑駁的青色。豚鼠、兔子的飼料成份基本一樣,只是比例略有不同,一般可以共用。因二者不能自身合成維生素C,所以苜蓿粉的比例較大。但,飼料是加水潤濕后,經高溫高壓而制成,維C及酶類等已部分破壞。豚鼠、兔子飼料不是全價飼料。因此,在飼料之外,仍要加少許青菜或青草,否則有的狀態不佳甚至死亡。本人也曾用在飲水中加維C片的方法,但效果似不如直接給予青菜。
三是狗的飼料。以肉粉、玉米、大豆、麩皮、魚粉為主,輔以復合維生素、骨粉、微量元素。有膨化飼料。一般要增加肉類食物。
四是猴的飼料。猴為雜食性。喂以混合精飼料并輔以蘋果、葫蘿卜。混合精飼料組成:玉米粉60%,谷粉20%,面粉15%,黃豆粉5%,再加上骨粉、魚粉、糖、食鹽、維生素等。幼齡動物通常要加上奶粉。以前常以上述組分加水混合,做成塊狀,烘干,但現在有膨化顆粒飼料出售。
對于小鼠,每日的飼料在4~8g,大鼠在15~20g;豚鼠在15~30g。兔在30~80g/kg/天。注意他們的嚙齒類動物行為,就是喜歡咬東西。因為它們的牙齒終生生長,于是它們要磨牙。這樣,投予過多飼料它們也會浪費掉。兔雖屬兔型目,但有類似嚙齒目動物的行為。
下圖中所示是一些實驗動物飼料配方的百分比(%)。
B 特殊飼料
這里主要是指一些用于造模的飼料。
1. 高脂飼料
這可能是zui常用的一種造模飼料。主要原理是通過外源性膽固醇、三酯的攝入形成高血脂、動脈粥樣硬化動物模型。zui常用的動物是大鼠、兔、金黃地鼠。也有用其它動物的,但通常以糊劑、乳劑灌胃來造模。
下面我們來談談高脂飼料的配制。
常用配方:豬油 10% 雞蛋黃 5% 膽固醇 1~2% 丙基硫氧嘧啶 0.2% 普通飼料 82.8~83.8% 另可酌加膽酸鹽 0.2% 左右,維生素D3等。
原理:豬油富含三酯;雞蛋黃是天然食物中含膽固醇zui高的;丙基硫氧嘧啶有助于成模,因甲狀腺素促進膽固醇的分解,而丙基抑制其作用;膽酸鹽主要是促進膽固醇的吸收;維生素D3主要是促進動脈粥樣硬化形成。
制法:膽固醇鱗片狀,研細;丙基研細;二者充分混合。取雞蛋煮熟,剝取蛋黃,捏碎,吹干,研成細粉,與前二者混合好。如要加膽酸鹽、維生素D3,亦將其混合好。然后以“等量遞增法”將上述藥料加入到普通飼料粉末中。再將豬油化開,噴灑在飼料粉末之中混勻。混好之后噴適量水為黏合劑,加到制粒機中制成棒狀飼料。
在此,特別提出“等量倍增法”。因上述造模藥料與普通飼料的量相差懸殊,直接加入其中是難以混勻的。這樣會造成以后動物攝入的造模的膽固醇,三酯差異大,不利于實驗。所謂“等量遞增法”就是:將上述藥料入差不多相等的普通飼料粉末充分混勻;得混合物后,再加與此混合物相等量的普通飼料混合,充分混勻;如此類推。比如:藥料為200g,*次混合后即為400g,第二次混合后為800g…這樣就成倍地混合好。因此,又稱為“等量倍增法”。因為相等量的不同物質混合時,相互混入對方的機率zui大,zui容易混勻。學過藥劑的朋友們是非常熟悉的,這在中藥的散劑中就是這樣做的。沒學過這個方法的朋友要特別關注。
目前有些飼料供應商稱可以提供現成的高脂飼料。一則他們很多根本就是胡亂地加入其中的,極不均勻,嚴重影響實驗。二則他們做的飼料中造模藥的比例不一定符合你的要求。很少有人懂得“等量倍增法”的原理及實用價值。因為目前飼料行業中專業人士多不會在一線,而是做管理工作。做飼料的多是沒有專業知識,而只是稍加培訓甚至沒有培訓的普通工人。當然,“等量倍增”的做法很簡單,關鍵是要有這樣的專業意識。做此飼料時,全程跟蹤,這樣才會對實驗結果心中有數。
在此,我一而再,再而三地強調“等量倍增法”配制飼料,就是為了站友們減少在此類實驗中的誤差。因為,有人問我,為什么他們的高脂組有些動物的血脂幾乎跟正常組沒有顯著差異,而有的又高很多,標準差如此地大?我*時間想到的就是飼料的配制是否有問題。如果飼料沒配好,實驗可能前功盡棄。 因此,不厭其煩地說兩句:高脂飼料要親自配,且按要求、按科學規律配(等量倍增法)。 飼料成形后,要攤開置通風處吹干,或以電風扇吹干。不要受熱。在春夏之季,尤應注意。因其中含有脂肪油類,且因制飼料時要經過高溫壓制,放在一起易發熱、生霉。有人置冰箱保存,實不妥。一則冰箱容量有限;二則飼料中的水分未盡,出冰箱后,冰化,更易生霉,且動物不是太喜歡吃冷藏后的飼料。一次配制飼料不宜過多。一般可配實驗全程所需飼料的一半。后半段根據前面所消耗的實際量來酌性增減。但需給足量,寧多一點,不能少。 高脂飼料比普通飼料要軟,易碎。要注意輕拿輕放。底部碎屑可收集起來,再壓制成型。
2. 缺鐵性貧血飼料
3. 缺鋅飼料
第五、實驗動物的飲水
下面我來介紹一下實驗動物飲用水的要求,以及飲水器具。
A 飲用水
實驗動物級別的不同,飲用的水也不同。 通常情況下,普通級動物飲水達到生活飲用水標準即可。 清潔級、SPF要求滅菌。可高溫高壓滅菌,也可以加次氯酸鈉,或以鹽酸調PH到2.5~3.0。后者又稱之為酸化水。 無菌動物飲水只能高溫高壓滅菌。