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采用粘末端連接必須對目的DNA分子和載體分子進行酶切以獲得相應的粘末端進行連接。酶切可以是單酶切也可以是雙酶切。單酶切操作比較簡單，但雙酶切如果兩種酶所用緩沖液成分不同（主要是鹽離子濃度不同）或反應溫度不同，這時可以采用如下措施解決：1）先用一種酶切，然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另外一種酶切；2）先進行低鹽要求的酶酶切，然后添加鹽離子濃度到高鹽的酶反應要求，加入第二種酶進行酶切；3）使用通用緩沖液進行雙酶切。具體要根據酶的反應要求進行，盡量避免星號活力。
一 材料、試劑和儀器：
1 材料：質粒DNA
2 試劑：限制性內切酶、ddH2O
3 儀器：微量移液槍，離心機，水浴鍋， 電泳儀，紫外透射觀測儀
實驗程序：
I. .單酶切：
II. 雙酶切：
注：酶切的選擇原則一般是盡量擴大酶切體系，這樣抑制因素得以稀釋；基因組DNA或質粒DNA酶的用量較一般DNA大，一般為1μg/10U;所加酶的體積不能超過酶切總體積的1/10，否則濃度會超過5%，會產生星號活力；對難切的質粒或基因組DNA應延長反應時間4―5hr, 甚至。滅火限制性內切酶活性可以采用加熱滅活，乙醇沉淀，酚/氯仿抽提，添加EDTA或SDS等方法，具體每一種酶可能有些方法不能*滅活，這一點需要注意。
二. 結果與分析：
圖1 重組質粒HindIII XbaI雙酶切瓊脂糖凝膠電泳分析
假若一種酶在環狀質粒DNA中只有一個酶切位點, 且酶切*，紫外燈下檢測電泳結果, 則單酶切應為一條帶, 而雙酶切則為兩條帶。如果條帶數目多于理論值,那么有可能是酶切不*。如果酶切結果與酶切前的質粒條帶一樣（超螺旋、線性和開環三條帶），則說明質粒*沒有被切開。
M1 ： λ DNA/ HindIII M2：DL2000 1 - 6: 重組質粒HindIII XbaI
重組質粒用HindIII XbaI雙酶切后釋放出插入片斷，因此空載體處于同一水平位置，而插入片斷長度分別為0.8 ,2.1 ,1.6 ,1.2 ,0.7和 0.3kb。
