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專題：轉染（transfection）--轉染試劑的選擇

2013-7-8　　閱讀(1855)

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下面我們為大家提供一些常用脂質體試劑的適用細胞系信息以及轉染FAQs：

1. promega公司

Promega轉染試劑產品適合于人HeLa，Hep G2，293，K562，Jurkat；猴COS-7，CV-1；小鼠NIH3T3；倉鼠BHK，CHO；大鼠PC12；昆蟲S19等等細胞系的RNAi轉染。詳情請參閱http：//www.promega.com.cn/files/cpxl/zhuanran/zhuanran.htm

針對同種陽離子脂質體的疑難解答

（1）沒有使用優化的陽離子脂質體試劑。解決建議：選擇針對您的細胞類型轉染效率可能zui高的陽離子脂質體試劑。參見附錄A或（www.invitrogen.com）上“Transfection Collection”中的參考文獻列表。

（2）沒有使用優化條件。解決建議：優化陽離子脂質體試劑和DNA的量。參見第7章優化步驟。參見（www.invitrogen.com在Tech-online分子生物學部分）上的細胞特異性的轉染步驟。

（3）DNA-陽離子脂質體試劑復合物在存在血清條件下形成。解決建議：在復合體形成時不要使用血清。OPTI-MEM I培養基和DMEM是用于復合體形成的較好的培養基。如果使用含有血清的培養基進行轉染，保證在無血清條件形成復合物。注意：不要將OPTI-MEM I培養基用于LIPOFECTAMINE PLUS試劑或昆蟲細胞。對于Sf9和Sf21細胞，Sf-900Ⅱ SFM會得到*結果。

（4）存在抑制劑。解決建議：不要在用于制備DNA-陽離子脂質體復合物的培養基中使用抗生素，EDTA，檸檬酸鹽，磷酸鹽，RPMI，硫酸軟骨素，透明質酸，硫酸葡聚糖或其他硫酸蛋白多糖。

（5）不恰當的細胞密度。解決建議：細胞密度應該在轉染時融合度為70%~90%。

（6）轉染DNA的啟動子-增強子沒有被宿主細胞識別。解決建議：確保轉染DNA的啟動子-增強子同目的細胞類型兼容。

（7）陽離子脂質體試劑凍結。解決建議：不要使用凍結的或儲存溫度低于4℃的陽離子脂質體試劑。

（8）轉染分析的問題。解決建議：轉染分析中加入陽性對照。

（9）質粒純化的問題。解決建議：請核對是否使用轉染級的質粒純化試劑盒。通常轉染級的質粒純化試劑盒使用DEAE樹脂而非硅樹脂，并且是用重力流動（過濾）的方法而不是離心技術，因為樹脂帶來的污染會導致較高的內毒素。另一種方法（可用于任何級別的純化試劑盒），是在zui后一步從樹脂柱上洗脫質粒后，將溶液置于55℃的水浴上保溫5分鐘。zui后小心地從上至下吸取2/3的溶液（不要碰到底部）使用。這是減少樹脂的交叉污染的方法。

Q2：細胞死亡率高。

A2：

（1）DNA量太高。解決建議：作一個劑量-反應曲線以確定*的DNA量。在劑量-反應轉染中加入陽離子脂質體試劑，因為單獨DNA也會對細胞生長有一個基礎的影響。參見第7章微調/優化方法。

（2）陽離子脂質體試劑量太高。解決建議：作一個劑量-反應曲線以確定*的陽離子脂質體試劑的量。在劑量-反應轉染中加入DNA，因為單獨陽離子脂質體試劑也只對細胞生長有一個基礎的影響。參見第7章微調/優化方法。

（3）在轉染過程中使用抗菌素。解決建議：在轉染過程中不要使用氯霉素，青霉素或鏈霉素，因為陽離子脂質體試劑使細胞更敏感。

（4）細胞太少。解決建議：作一個劑量-反應曲線以確定每個轉染過程中*的細胞數量。根據您的應用所要求的效率調整細胞數量。

（5）在無血清條件下細胞活性降低。解決建議：使用OPTI-MEMⅠ培養基。降低或省去在無血清培養基中清洗的次數。在轉染培養基中使用5%到10%的血清。確保在不存在血清的條件下形成復合物。

（6）陽離子脂質體試劑氧化了。解決建議：不要過分攪動或振蕩陽離子脂質體試劑；這可能會形成陽離子脂質體試劑的過氧化物。

（7）對于穩定轉染，篩選抗生素加入的太快。解決建議：在加入篩選性抗生素前至少預留48小時使細胞表達抗性基因。

Q3：陽離子脂質體試劑-DNA復合物沉淀。注意：在顯微靜下可以在細胞上觀察到小的顆粒狀顆粒沉淀。這是正常的。此沉淀是否存在并不表明轉染效率的高低。

A3：
（1）存在過剩的EDTA。解決建議：使用DNA水溶液，如果是在TE中，使用濃度<0.3mM的EDTA溶液稀釋DNA。
（2）DNA或陽離子脂質體試劑濃度過高。解決建議：確保陽離子脂質體試劑和DNA的濃度不要超過復合物形成的建議量（參見表5）。

Q4：轉染重復性不好。

A4：
（1）轉染時的融合度波動。解決建議：在不同的轉染時報持所有的轉染參數恒定，如融合度，傳代次數和生長時相等。

（2）在培養中細胞發生變化。解決建議：如果可能，使用來源于經選擇轉染效率較高亞系的細胞。如果可能，融化新鮮細胞。

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