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ELISPOT技術(shù)原理和技術(shù)特點

2013-6-30　　閱讀(1574)

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ELISPOT全名為酶聯(lián)免疫斑點檢測，英文：Enzyme-linked Immunospot Assay。它結(jié)合了細胞培養(yǎng)技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（即ELISA技術(shù)），能夠在單細胞水平檢測細胞因子的分泌情況。其技術(shù)原理，一句話概括就是：用抗體捕獲培養(yǎng)中的細胞分泌的細胞因子，并以酶聯(lián)斑點顯色的方式將其表現(xiàn)出來（Sedgwick JD 2005）。

該技術(shù)檢測細胞因子具有三大優(yōu)點：其一，靈敏度高。在一百萬個陰性細胞中只要有一個分泌細胞因子的陽性細胞即可被檢測出來。這是目前為止，zui為靈敏的檢測技術(shù)，靈敏度比傳統(tǒng)的的ELISA方法高2-3個數(shù)量級。其二，單細胞水平，活細胞功能檢測。ELISPOT檢測的是單個細胞分泌，而非細胞群體的平均分泌。在檢測的過程中，有活細胞培養(yǎng)與抗原刺激階段，檢測的是活細胞的功能，而非死細胞的物。其三，操作簡便經(jīng)濟，可以進行高筒量篩選。ELISPOT沒有復(fù)雜的細胞體外擴增過程，不使用同位素，不需要大型的、專門的實驗儀器設(shè)備。按照標準化的實驗操作，一個實驗者可以同時處理數(shù)百個樣品，效率遠遠高于其它檢測方法（Kalyuzhny AE 2005）。

實驗設(shè)計在96孔培養(yǎng)板上進行，直接以培養(yǎng)板的塑料板底或者PVDF膜以及硝酸纖維素膜為基質(zhì)，包被上特異性的單克隆抗體，用以捕獲細胞分泌的細胞因子。（由于涉及到細胞培養(yǎng)的過程，對單克隆抗體的要求要遠高于ELISA中的捕獲抗體，該抗體需要無毒，不含內(nèi)毒素，親和力高等特點。）之后，在培養(yǎng)板的孔內(nèi)加入細胞培養(yǎng)基（現(xiàn)在無血清ELISPOT技術(shù)已經(jīng)成熟，培養(yǎng)基中可以不再含有血清）、待檢測的細胞以及抗原刺激物進行培養(yǎng)。

在特異性的抗原或者非特異性的有絲分裂原的刺激下，數(shù)小時之內(nèi)，T細胞就會開始分泌各種細胞因子。細胞因子當(dāng)即就被位于細胞下方的膜上的單克隆抗體所捕獲。在洗去細胞之后，被捕獲的細胞因子可以與生物素標記的第二抗體結(jié)合，然后用酶標親和素再與生物素結(jié)合，進行化學(xué)酶聯(lián)顯色，就可以在膜的局部形成一個個圓形的斑點。每一個斑點就對應(yīng)了當(dāng)初一個分泌細胞因子的細胞，這些細胞被稱為斑點形成細胞（Spots forming cells SFCs）。統(tǒng)計膜上的斑點的數(shù)目，再除以當(dāng)初加入孔內(nèi)的細胞總數(shù)，就可以計算出陽性細胞的頻率。

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