国产一卡2卡三卡4卡麻豆_了解最新日韩草逼视频_h片在线播放一区_国产激情影视在线_好了av四色综合无码久久_欧美黑白双插OOR720P_日本精品中文字幕在线_秋霞午夜手机影院_亚洲国产一区二区3da毛片_欧美杂交深喉video中文字幕

上海北諾生物科技有限公司

中級會員·13年

聯系電話

15800960770

您現在的位置： 首頁> 技術文章 > 細胞凋亡實驗步驟及注意事項
中級會員·13年
聯系人：
周經理 劉經理
電話：
021-57730393
手機：
15800960770
傳真：
86-021-61496710
地址：
上海市徐匯區宜山路520號中華門大廈18樓D座
個性化：
www.bnbiotech.com
網址：
www.bnbiotech.com

掃一掃訪問手機商鋪

細胞凋亡實驗步驟及注意事項

2013-6-16　　閱讀(1350)

分享：

一、實驗目的

1、掌屋凋亡細胞的形態特征
　　2、學會用熒光探針對細胞進行雙標記來檢測正常活細胞、凋亡細胞和壞死細胞的方法

二、實驗原理

細胞死亡根據其性質、起源及生物學意義區分為凋亡和壞死兩種不同類型。凋亡普遍存在于生命界，在生物個體和生存中起著非常重要的作用。它是細胞在一定生理條件下一系列順序發生事件的組合，是細胞遵循一定規律自己結束生命的自主控制過程。細胞凋亡具有可鑒別的形態學和生物化學特征。

在形態上可見凋亡細胞與周圍細胞脫離接觸，細胞變園，細胞膜向內皺縮、胞漿濃縮、內質網擴張、細胞核固縮破裂呈團塊狀或新月狀分布、內質網和細胞膜進一步融合將細胞分成多個完整包裹的凋亡小體，凋亡小體zui后被吞噬細胞吞噬消化。在凋亡過程中細胞內容物并不釋放到細胞外，不會影響其它細胞，因而不引起炎癥反應。

在生物化學上，多數細胞凋亡的過程中，內源性核酸內切酶活化，活性增加。核DNA隨機地在核小體的連接部位被酶切斷，降解為180-200bp或它的整倍數的各種片斷。如果對核DNA進行瓊脂糖電泳，可顯示以180-200bp為基數的DNA ladder（梯狀帶紋）的特征。

相比之下，壞死是細胞處于劇烈損傷條件下發生的細胞死亡。細胞在壞死早期即喪失質膜完整性，各種細胞器膨脹，進而質膜崩解釋放出其中的內容物，引起炎癥反應，壞死過程中細胞核DNA雖也降解，但由于存在各種長度不等的DNA斷，不能形成梯狀帶紋，而呈彌散狀。

一些溫和的損傷刺激及一些抗腫瘤藥物可誘導細胞凋亡，通常這些因素在誘導凋亡的同時，也可產生細胞壞死，這取決于損傷的劇烈程度和細胞本身對刺激的敏感程度。

三尖杉酯堿（HT）是我國自行研制的一種對急性粒細胞白血病，急性單核白血病等有良好療效的抗腫瘤藥物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范圍內作用2小時，即可誘導HL-60細胞凋亡，并表現出典型的凋亡特征。本實驗用1μg/ml HT在體外誘導培養的HL-60細胞發生凋亡，同時也有少數細胞發生壞死。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）對細胞進行雙重染色，可以區別凋亡、壞死及正常細胞。

細胞膜是一選擇性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿過質膜。當細胞壞死時，質膜不完整，PI就進入細胞內部，它可嵌入到DNA或RNA中，使壞死細胞著色，凋亡細胞和活細胞不著色。而一些活細胞染料由于為親脂性物質，可跨膜進入活細胞，因而可進行活細胞染色。Hoechst33342是一種活性熒光染料且毒性較弱，它是雙苯并咪唑的一種衍生物。與DNA特異結合（主要結合于A-T）堿基區），顯示凋亡細胞和活細胞。凡是看到有凋亡小體的細胞都是凋亡細胞。

三、實驗用品

1、試劑：三尖杉酯堿（HT），300μg/ml，100mmol/L Tris-HCl（pH7.5），5mol/L EDTA緩沖液、堿性裂解液：0.2mol/L NaOH, 1%SDS、醋酸鈉：3mol/L KAc（pH4.8）；異丙醇；70%乙醇；溴酚藍，蔗糖指示劑。TBE電泳緩沖液，1%瓊脂糖，溴乙錠。PI母液：500μg/ml；Ho33342母液：2mmol/L。
　　2、儀器設備：熒光顯微鏡，電泳儀，電泳槽，微量加樣器（1ml，100μl）0.5、1.5ml離心管，載玻片，蓋玻片。

四、實驗材料

人早幼粒白血病HL-60細胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培養基在37℃，5%CO2條件下培養。

五、方法步驟

1、三尖杉酯堿誘發HL-60細胞凋亡
　　（1）實驗前約24小時，接種兩瓶HL-60細胞，標記①、②，每瓶含約6ml培養液，置37℃，5%CO2培養箱培養。
　　（2）實驗前約2.5小時，當細胞密度達到70%，①號瓶加入三尖杉酯堿200μl，使終濃度為1μg/ml，②號瓶中加入同等量PBS（pH7.4）作對照。共同放入培養箱中繼續培養2.5小時。

2、Ho33342和PI雙重染色鑒別三種細胞
　　（1）染色：將瓶中的細胞搖勻取200μl于1.5ml的離心管中，加入Ho33342母液2μl，PI 20μl，染色15分鐘。
　　（2）滴片：取一載玻片用雙面膠圍成一小室，從離心管中各取以上染色后的細胞懸液10μl，加入小室內蓋上蓋玻片，熒光鏡下用紫外激發光，高倍鏡下觀察，區別三種細胞，并注意三者比例。

六、注意事項

1、誘導培養HL-60細胞時間要準確；
　　2、熒光顯微鏡下觀察細胞時，由于熒光易碎滅，觀察時要盡量快

會員登錄

×

請輸入賬號

請輸入密碼

=

請輸驗證碼

收藏該商鋪

X
該信息已收藏！
標簽：
保存成功

(空格分隔,最多3個,單個標簽最多10個字符)

常用：

提示

X
您的留言已提交成功！我們將在第一時間回復您~
產品對比 二維碼 在線交流

掃一掃訪問手機商鋪

對比框

在線留言
主站蜘蛛池模板： 克山县| 杭锦旗| 鸡泽县| 新密市| 卢龙县| 文登市| 陕西省| 简阳市| 敖汉旗| 司法| 赤峰市| 越西县| 闽清县| 家居| 高雄县| 时尚| 安国市| 梧州市| 丹寨县| 濉溪县| 青岛市| 佛教| 渝中区| 台北市| 武安市| 湖口县| 郁南县| 尉氏县| 伊金霍洛旗| 大方县| 汤原县| 怀来县| 关岭| 赤峰市| 临武县| 新巴尔虎左旗| 阆中市| 秦皇岛市| 方城县| 汉沽区| 普安县|