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研域(上海)化學(xué)試劑有限公司

開發(fā)新型CLIP技術(shù)

時(shí)間:2016-5-9閱讀:949

   有數(shù)以百計(jì)的蛋白質(zhì)可以與RNA結(jié)合,但是弄清有哪些蛋白在哪里結(jié)合RNA,以及它們相互作用之后發(fā)生了什么,一直都是一個(gè)挑戰(zhàn)。
   除了轉(zhuǎn)錄調(diào)控之外,還有更多的基因調(diào)控。隨著研究人員越來越意識(shí)到RNA所扮演的不同角色,尋找這些核酸和RNA結(jié)合蛋白(RBPs)之間的相互作用,就顯示出更大的重要性。數(shù)以百計(jì)的RBPs是已知的——其中很多涉及各種疾病,如神經(jīng)退行性變、自身免疫缺陷和癌癥,但是大部分仍有待于發(fā)現(xiàn)。發(fā)現(xiàn)RBPs結(jié)合的序列,可以闡明它們調(diào)控RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、處理以及翻譯的機(jī)制。
發(fā)現(xiàn)RBPs結(jié)合位置的先進(jìn)的方法,依賴于核糖核蛋白復(fù)合物的交聯(lián)和免疫沉淀反應(yīng)(CLIP),然后進(jìn)行測(cè)序。這些程序在技術(shù)上具有挑戰(zhàn)性,需要放射性,實(shí)驗(yàn)的失敗率很高,并會(huì)產(chǎn)生高百分比的重復(fù)讀取。當(dāng)執(zhí)行大規(guī)模CLIP實(shí)驗(yàn)作為ENCODE聯(lián)盟的一部分時(shí),我們認(rèn)為,當(dāng)前方法沒有足夠的能力分析數(shù)以百計(jì)的因素。研究人員創(chuàng)建了加強(qiáng)型的CLIP (eCLIP),來解決這些問題。
   適配子(可允許隨后的匯集),與附著于免疫沉淀反應(yīng)珠子上的RNA片段連接起來。然后,他們通過電泳和消化掉蛋白質(zhì),分離了復(fù)合物。在反轉(zhuǎn)錄RNA后,他們?cè)赑CR擴(kuò)增之前,將另一個(gè)包含內(nèi)聯(lián)隨機(jī)5-或10-mer的3 '適配子,連接到現(xiàn)在的單鏈DNA上。
   逆轉(zhuǎn)錄往往會(huì)在交聯(lián)部位終止,這可讓研究人員獲得核苷酸分辨率。在相同的順序讀取的情況中,隨機(jī)單鏈DNA適配子序列,將能夠區(qū)分來自PCR副本的*片段,讓后者被丟棄,從而使映射讀取的數(shù)量更為定量,并減少了浪費(fèi)的測(cè)序。此外,eCLIP為非特異性背景和固有偏誤,添加了一個(gè)大小匹配的免疫沉淀反應(yīng)前對(duì)照。
   這些修改意味著,為了獲得更高比例的可用讀數(shù)并產(chǎn)生具有足夠復(fù)雜性的文庫,eCLIP需要的擴(kuò)增比其他方法少大約1000倍,以識(shí)別更混雜的RBPs所使用的序列?,F(xiàn)在,我們可以使用這些序列,來弄清RBPs如何完成它們的作用。

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