其實是這么回事，用常用的Nile  red熒光染料飼喂的線蟲把這種染料當作毒物處理了：染料被隔離到脂肪粒周圍的腸類溶酶體顆粒中，而不是脂肪粒中。實際上，這種染料還在別的方面具有誤導性：他汀類本身似乎會影響它的染色或者熒光。“在使用熒光基團的時候，有很多假象要考慮到。” 來自位于瑞典查爾姆斯理工大學的Enejder說。
    沒人能夠否定熒光探針和分子染色在細胞內行為探測上的實力，但是這種標記辦法仍然有諸多問題。如何標記是一個問題，尤其是對整個有機體而言。有些標記只能在已死亡的細胞內有作用；其他的標記標記方法則會損傷細胞，或者干擾所研究的生物過程。非標記的顯微技術提供了一種能夠大幅度降低人為干擾的活體觀察技術。雖然有些技術仍然依賴內源性熒光基團，不過它們基本上可以摒棄熒光技術，也就避免遇到光漂白這個常見問題。這些新技術探測的是光在通過生物樣品時被吸收或者改變時發生的微小變化，而不是探測被激發熒光基團的光子。這種辦法依賴在高光功率密度下觀察到的非線性光學過程。一言以蔽之，激光脈沖可以被用來“看”化學組成：脂質里面的C-H鍵，蛋白質里的酰胺鍵，還原態或者氧化態的生物分子，膠凝蛋白或者微管里面有規律地重復的單元。當然，這樣的技術也自有其局限性：與熒光標記能夠識別單分子相比，非標記技術的靈敏度和特異性都要弱一些。只有特別常見的基團才不會淹沒在一些豐富樣品產生的信號當中。“這種技術的好處是，你不需要任何標記，你只需要去成像就行了”，信號太弱了，你需要大量能量來照射一個細胞，而可能僅僅得到一些粗枝大葉的細節。
    這種技術通過一種叫做自發拉曼散射的現象來增強信號。在自發拉曼散射中，樣品內的化學鍵能夠改變通過其中的光的波長。更早使用的拉曼散射顯微術要求的激光功率很高，而且有時候需要曝光時間長達一天。謝曉亮和他的同事證明，CARS可以用于活細胞研究。通過使用兩束激光，它們的頻率差等于需要成像化學鍵的振動頻率，細胞產生的微弱的拉曼信號能夠被不斷放大。“它的靈敏度比自發拉曼散射的靈敏度高了好幾個數量級”，謝曉亮說。但是CARS也有缺陷。在同一時間里，它只集中在很寬的拉曼譜中很短的一段，限制了所能采集的信號的數量；同時還帶來了很高的背景信號。從實用的角度講，這些限制意味著如果要應用CARS技術，大部分時間要基于對脂質的探測，因為碳氫鍵的大量富集能夠產生很強的特征信號的合作研究獲得對該技術的原理的證據的。謝曉亮甚至預言，SRS技術有一天會取代CARS技術，然而其他研究人員對此有所保留。SRS需要對多個光源的信號進行混合和解讀，而譜的疊加也會使去卷積變得困難。他曾經嘗試用SRS觀察溶液中的核酸，zui后還是決定繼續使用原來的老技術。利用那些老技術，就可以從細胞的DNA里分辨出RNA。他說，盡管拉曼顯微鏡可能慢一些，“但是應用SRS技術來擴展我們的知識也挺費勁的，跟使用傳統拉曼技術差不多。”
    采購與分享
    謝曉亮預計，一旦SRS被植入商用系統，很快就會傳播開來，他認為早在今年底之前就會取得這樣的進展；據報道，蔡司和徠卡已經于去年獲得這項技術的授權。然而，就像熒光顯微鏡的前車之鑒，技術的傳播可能相當緩慢。*臺商用多光子顯微鏡于1996年發布；而2003年的一項調查發現，66%使用多光子顯微鏡的生物學研究仍然使用定制系統。現在，商用多光子顯微鏡則相當普遍。
   樣的光源，切換到共聚焦拉曼來做同一個區域更詳細的化學成分分析。新近關于人類前列腺腫瘤細胞的研究發現，先前被認為由脂肪組成的區域，實際上是被氧化的脂肪酸。下一步是考察這種脂肪酸會否可以用于標記前列腺癌的嚴重性。在別的項目中，程繼新已經發展了一個平臺，可自動收集CARS信號的來觀測脂肪，還利用一種叫做和頻產生的技術看到特定的蛋白纖維。有了這種技術，程繼新及其合作者們可以研究富脂免疫細胞如何將自己嵌入到血管壁的膠原蛋白基質中去的——這類觀測可以揭示動脈粥樣硬化中的血塊是如何形成的。程繼新和他的同事還獨立監測了多發性硬化癥的老鼠模型中的神經元髓鞘，并且地指出是軸突的某個地方出現了損傷。他說，“以前在活體組織中對髓鞘的監測是沒有辦法達到單細胞水平的，髓鞘因為緊密堆積了大量脂質，特別適合用CARS成像。非標記顯微技術在其他方面的應用則可能沒那么容易。他說經常使用激光器的研究人員很可能會想辦法采用這樣的技術，他補充道，“技術上講，這是*可行的，但是如果我能用另一種方式來獲得同樣的信息，我為什么要采用這個多少有些復雜而且昂貴的
  問題在于，能夠很好地實現這一目標的分子非常少。為了達到好的效果，Yuste說，“你需要非常仔細地去掃描全譜，來尋找潛在的內源性二次諧波發色基團。”他說，發展這種技術需要依賴學科交叉，需要研究人員在他們研究領域的邊緣工作。但是在現實中，這種工作往往在研究者們自己的系里得不到足夠的資金和支持，這也是為什么能夠實現這一目標的分子資源較少的原因。
   Enejder等人相信，學科交叉能夠幫助人們解決大量只能由非標記的非線性顯微技術來觀測的問題。雖然Enejder的背景的是物理學，她還是轉到了生物系。因為在那里可以更容易的了解生物學家們在成像上到底遇到了什么問題，非線性光學如何才能幫得上忙。她說，那些把自己的眼光牢牢地局限在物理系內部的人可以繼續優化技術，但是他們或許不了解生物學家到底希望看到什么：“我就*沒有這個問題。在我眼里，應用隨處可見僅僅依賴別人文章里說的哪些可以觀測是不行的，你得自己去試才行。”