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北京西美杰科技有限公司
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CHOgro® High Yield Expression系統(tǒng)，高效、穩(wěn)步提升CHO細胞蛋白表達
2023-10-20 閱讀(349)
中國倉鼠卵巢（CHO）細胞，已成為治療用蛋白類生物制品生產的主要細胞類型。隨著瞬時轉染技術(transient transfection)的進步，搭配CHO細胞進行毫克至克級別蛋白的快速、高效生產，幫助推動藥物研發(fā)階段進程，允許更早的評估候選藥物是否具備理想屬性，從而投入更多資源生成穩(wěn)定的克隆細胞系，用于后續(xù)藥物的臨床開發(fā)。
憑借20年在核酸遞轉領域的深耕細作，Mirus推出了用于CHO細胞蛋白/抗體生產的完整瞬轉系統(tǒng)——CHOgro® High Yield Expression System。通過整合Mirus轉染技術及優(yōu)化的CHO培養(yǎng)基，相比于現(xiàn)有技術方案，可將蛋白表達量提升2-10倍。除此之外，該系統(tǒng)不含動物源性成分，致力于穩(wěn)定的提高懸浮CHO細胞的蛋白質產量。本文首先就影響CHO細胞在蛋白表達實驗中的關鍵影響因素進行討論，包括轉染試劑、培養(yǎng)基選擇、增強子使用及培養(yǎng)溫度優(yōu)化；Mirus CHOgro® High Yield Expression System體系，綜合考慮上述影響CHO蛋白表達的關鍵因素，并且將轉染試劑、培養(yǎng)基及增強子進行優(yōu)化、整合；最后，結合Mirus CHOgro® High Yield Expression System針對不同蛋白/抗體類型的表達產量、體系放大以及細胞類型適配性數(shù)據(jù)，充分證明了Mirus CHOgro® High Yield Expression System具備高產量、高穩(wěn)定性、廣泛的適配性以及操作靈活性等優(yōu)勢。
Mirus CHOgro® High Yield Expression System（產品貨號：MIR 6270）中包括了以下組分：
產品名稱 | 規(guī)格 | 單組分貨號 |
TransIT-PRO® 轉染試劑 | 1 x 1 mL | MIR 5740 |
CHOgro® Titer Enhancer | 1 x 20 mL | MIR 6220 |
CHOgro® Expression Medium | 2 x 1 L | MIR 6200 |
CHOgro® Complex Formation Solution | 1 x 100 mL | MIR 6210 |
Poloxamer 188, 10% | 1 x 100 mL | MIR 6230 |
L-glutamine, 200 mM | 1 x 100 mL | MIR 6240 |
CHO細胞蛋白表達關鍵影響因素之轉染試劑
CHOgro® High Yield Expression System系統(tǒng)中關鍵組分TransIT-PRO®轉染試劑，通過優(yōu)化瞬時轉染效率，可進一步提高目標蛋白/抗體產量。同樣的，該轉染試劑不含動物源成分，可以與懸浮CHO或者293細胞搭配使用，并且可以兼容不同種類的培養(yǎng)基，旨在提高生產蛋白/抗體產量及穩(wěn)定性。
測試使用CHOgro® High Yield Expression System系統(tǒng)中TransIT-PRO®轉染試劑（試劑:DNA比例為1:1），在CHO-S細胞瞬轉表達GFP熒光蛋白。轉染后48小時，分別使用流式細胞儀和熒光顯微鏡檢測試劑轉染效率和細胞活力。結果表明，單獨使用TransIT-PRO®轉染試劑，可達到高水平的轉染效率（圖1）。
圖1. 單獨使用Mirus CHOgro® High Yield Expression系統(tǒng)中的轉染試劑（TransIT-PRO® 轉染試劑），也有著高水平的轉染效率。
CHO細胞蛋白表達實驗關鍵影響因素之培養(yǎng)基
CHOgro® High Yield Expression System中的另一關鍵組分CHOgro® Expression Medium，也是提升CHO細胞蛋白/抗體表達量的重要因素。細胞的生長狀態(tài)、是否結團、細胞密度等都是評估CHO細胞培養(yǎng)基的關鍵參數(shù)。
在細胞生長狀態(tài)方面，轉染FreeStyle™ CHO-S細胞后，分別在CHOgro® Expression Medium和其他品牌培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。轉染后六天，用CHOgro® High Yield Expression System中的CHOgro® Expression Medium培養(yǎng)的細胞結團數(shù)量明顯少于其他品牌培養(yǎng)基（圖2）。
圖2. 使用Mirus CHOgro® High Yield Expression System中的CHOgro® Expression Medium進行培養(yǎng)（左），細胞結塊數(shù)量顯著少于其他培養(yǎng)基培養(yǎng)的CHO-S細胞（右）。
同樣的，使用相同細胞系（FreeStyle™ CHO-S）及細胞密度（0.5×106 cells/ml），平行比較Mirus CHOgro® Expression培養(yǎng)基及其他品牌培養(yǎng)基。實驗結果顯示，在Mirus CHOgro® Expression培養(yǎng)基中生長的細胞，有著更高的細胞密度，這也是提高CHO細胞蛋白/抗體產量的重要前提。并且，在更高的細胞密度條件下，仍保持較高的細胞活性（圖3）。
圖3. 使用CHOgro® Expression Medium培養(yǎng)，CHO細胞密度更高，并且保持著較高細胞活性。
CHO細胞蛋白表達實驗關鍵影響因素之增強子
使Mirus研發(fā)團隊針對不同應用或者細胞類型，開發(fā)出多種相適配增強子，例如針對CHO細胞蛋白/抗體生產的增強子CHOgro® Titer Enhancer，也是包含在CHOgro® High Yield Expression System中的一個關鍵組分。其作用機制并非直接增加細胞的轉染效率，而是通過調節(jié)細胞內特定的信號通路來增加CHO細胞的蛋白表達滴度。平行實驗分別對比了CHO細胞對Fc融合蛋白與IgG的表達量，結果表明，與單獨使用TransIT-PRO® 轉染試劑相比，加入CHOgro® Titer Enhancer后，CHO細胞Fc融合蛋白的產量有顯著提升（圖4）。此外，與PEI轉染體系相比，使用CHOgro系統(tǒng)的轉染試劑和增強子，CHO細胞IgG的表達量可提高約3倍（圖5）。
圖4. 加入CHOgro® Titer Enhancer后，CHO細胞Fc融合蛋白的產量有顯著提升
圖5. TransIT -PRO®轉染試劑搭配CHOgro® Titer Enhancer，相較于PEI轉染體系，CHO細胞IgG的表達量可提高約3倍
CHO細胞蛋白表達實驗關鍵影響因素之培養(yǎng)溫度
Mirus CHOgro® High Yield Expression System除了通過培養(yǎng)基、轉染試劑以及增強子三者的優(yōu)化結合，在實驗流程上也可以進行優(yōu)化，從而進一步提高蛋白產量。根據(jù)科研或者不同應用需求，Mirus CHOgro® High Yield Expression System有著多種靈活實驗方案供選擇：
方案一：Mirus CHOgro® High Yield Expression System實驗方案中所推薦的標準流程，即在轉染當天加入CHOgro® Titer Enhancer，并立刻將細胞培養(yǎng)溫度從37℃轉移至32℃，轉染后7-8天內收獲蛋白，細胞活性仍可保持70%以上；
方案二：在方案一的基礎上通過添加補料來延長細胞培養(yǎng)時間，保證細胞更長時間維持較高的密度和活率，將蛋白收獲時間延長至7-11天；
方案三：轉染后的細胞仍維持在37℃條件下培養(yǎng)，不加入補料，并在最短時間（4-5天）收獲蛋白；
方案四：轉染后的細胞仍維持在37℃條件下培養(yǎng)，通過在轉染后18-24小時添加補料維持細胞密度和活率，將蛋白收獲時間延長至4-7天。（有關添加細胞培養(yǎng)補料以維持細胞活率的建議，請參閱完整版實驗方案）（圖6）。
圖6. CHOgro® High Yield Expression System的多種細胞培養(yǎng)方案
基于以上四種實驗方案，分別測試了在轉染后32℃和37℃培養(yǎng)條件下，以及是否添加補料對CHO細胞IgG產量的影響。實驗使用CHOgro® High Yield Expression System，加入轉染復合物及CHOgro® Titer Enhancer后，立即將CHO細胞轉移至32℃（左）或保持在37℃（右）。結果顯示，轉染后將細胞轉移到32℃條件下培養(yǎng)，IgG產量更高且細胞存活時間更長（圖7）。
圖7. 轉染后將細胞轉移到32℃條件下培養(yǎng)，IgG產量更高且細胞存活時間更長
盡管Mirus CHOgro® High Yield Expression System從CHO細胞蛋白表達實驗關鍵組分即轉染試劑、培養(yǎng)基和增強子進行了優(yōu)化整合，并提供了靈活的實驗應用方案來提升CHO細胞的蛋白產量，那么在實際生產過程中，該系統(tǒng)針對不同類型蛋白/抗體的產量、體系放大以及細胞類型適配性如何呢？
Mirus CHOgro® High Yield Expression System針對不同類型蛋白/抗體的表達，有著更高產量
使用相同的細胞類型（FreeStyle™ CHO-S cells）和質粒骨架，分別表達六種不同的治療性抗體，比較測試了Mirus CHOgro® High Yield Expression System和其他品牌表達系統(tǒng)。實驗結果表明，在所有測試的六種抗體類型中，使用Mirus CHOgro® High Yield Expression System的CHO細胞表達的蛋白滴度更高，并且轉染試劑用量更少，蛋白生產成本更低（圖8）。
圖8. 相比其他品牌CHO轉染表達系統(tǒng)，Mirus CHOgro® High Yield Expression System有著更高的蛋白產量
CHOgro® High Yield Expression System生產規(guī)模的可擴展性
通過對6孔板（細胞培養(yǎng)體積2mL）至5L搖瓶（細胞培養(yǎng)體積2L）等不同培養(yǎng)體積進行轉染，對CHOgro® High Yield Expression System生產規(guī)模的可擴展性進行評估，實驗結果表明，從最小反應體系（6孔板）至最大反應體系（5L搖瓶），生產體系放大了1000倍，都有著近似的蛋白滴度，意味著CHOgro® High Yield Expression System可以整合到不同CHO細胞蛋白/抗體研究和生產工作流中（圖9）。
圖9. Mirus CHOgro® High Yield Expression System的生產體系擴大1000倍，依然保持著近似的蛋白產量。
CHOgro® High Yield Expression System不同CHO細胞適配性
選擇兩種常用于蛋白/抗體生產的CHO懸浮細胞CHO-S和ExpiCHOTM，評估CHOgro® High Yield Expression System對不同CHO細胞類型的適配性。實驗結果表明，CHOgro® High Yield Expression System可適配多種CHO細胞類型，在不同CHO細胞中的蛋白表達也有著近似的產量（圖10）。
圖10. Mirus CHOgro® High Yield Expression System可適配不同CHO細胞類型
綜合上述，通過上述Mirus CHOgro® High Yield Expression System的測評數(shù)據(jù)，表明了該系統(tǒng)具有以下特點及優(yōu)勢：
更高的蛋白產量：可將CHO細胞瞬轉的蛋白表達量提升2-10倍
可穩(wěn)定放大生產體系：將轉染體系放大1000倍，其蛋白表達量依然保持穩(wěn)定
適配不同類型CHO細胞：搭配不同類型CHO細胞也可得到近似蛋白產量
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Mirus產品年鑒
美國Mirus公司成立于1995年，是世界上很早開發(fā)高效、低毒轉染試劑的公司，同時也是該類試劑的主要供應商之一。其產品線涵蓋化學轉染試劑、電轉染產品、病毒生產和轉導產品，適用于基因功能研究、蛋白生產、病毒載體生產和動物模型構建等領域。
北京西美杰科技有限公司是Mirus中國區(qū)代理，始終秉承著專業(yè)、嚴謹?shù)膽B(tài)度為客戶提供優(yōu)質的產品與服務，Mirus熱銷轉染產品常備現(xiàn)貨。北京西美杰是 Mirus代理， Mirus中國代理， Mirus北京代理， Mirus總代理， Mirus上海代理，， Mirus西北代理， Mirus西南代理， Mirus東北代理， Mirus華北代理， Mirus華南代理， Mirus華中代理，負責 Mirus在中國的相關業(yè)務。
