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western blot 實驗經(jīng)驗總結(jié)（一）
western blot 實驗經(jīng)驗總結(jié)（一） 問題：zui近做 western blot 實驗，目的蛋白大小是 25 kD。實驗結(jié)果顯示，目的條帶處無任何信號，而內(nèi)參條帶清晰。同樣條件下，內(nèi)參照效果很好，為何目的條帶卻檢測不到？且據(jù)文獻報道，同種樣品中該蛋白是高豐度的。
WB 檢測中蛋白質(zhì)條帶無信號的可能性有：目的蛋白在樣品中沒有表達；目的蛋白在樣品處理過程中發(fā)生降解；一抗或二抗質(zhì)量差；抗體濃度不合適；轉(zhuǎn)膜效果不好，膠上蛋白沒有轉(zhuǎn)到膜上或者轉(zhuǎn)過了。首先，用考馬斯亮藍染色轉(zhuǎn)過膜的 SDS-PAGE 膠，結(jié)果未看見明顯條帶，說明轉(zhuǎn)膜后膠上基本沒有蛋白。其次，抗體購自高信譽的試劑公司，暫時不考慮是抗體質(zhì)量問題導(dǎo)致成實驗失敗。另外文獻已報道該樣品中目標(biāo)蛋白表達較高，排除不表達的可能性。且處理樣品的過程非常短，保存得當(dāng)，未檢測到降解條帶，因此排除樣品降解。
zui后，膜和轉(zhuǎn)膜條件。內(nèi)參條帶清晰，目標(biāo)條帶分子量較小，排除沒有轉(zhuǎn)到膜上。因此zui大可能是蛋白轉(zhuǎn)過了，用小孔徑膜，縮短轉(zhuǎn)膜時間。
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