ELISA試劑盒在國內有很多種叫法，例如：ELISA檢測試劑盒、酶聯免疫試劑盒、ELISA Kit、酶聯免疫吸附測定試劑盒、酶免試劑盒等、酶聯免疫分析試劑盒，比較常見的叫法是ELISA試劑盒、酶聯免疫吸附測定試劑盒等，常見的有國產，進口分裝和進口原裝。自從60-70年代問世以來，便得到世界科研工作者的極度認可及推崇，在歐美及中國獲得大量的推廣，尤其是國內生化領域的發展。 Elisa生物試驗是一種敏感性高，特異性強，重復性好的實驗診斷方法。由于其試劑穩定、易保存，操作簡便，結果判斷較客觀等因素，已廣泛應用在免疫學檢驗的各領域中。

ELISA試劑盒原理
免疫測定技術的基礎在于抗原抗體之間的特異結合反應，所以任何的診斷試劑離不開的原料，如抗原酶、抗體等。以前用于免疫測定的抗原通常為各種純化抗原，而抗體則為純化抗原免疫動物后獲得的多克隆抗體和使用雜交瘤技術得到的單克隆抗體，而抗原或抗體的標記物如酶標結合物則通過各種化學合成方法制備。近年來，隨著分子生物學的發展，使用基因工程方法制備各種特殊的抗原或抗體及其酶結合物等免疫測定試劑幾成為現實的新一代試劑，各種新型使用的測定方法也不斷出現。
HBsAg試劑特點（檢測模式：臨床抗體夾心法）：包被抗體為山羊多抗。多抗具有高親和性和對抗原各種表位的反應性。酶表抗體為與HBsAg有不同結合位點的鼠復合單位，可測得HBsAg變異樣品，提高檢測的特異性（99.98%）提高檢測的靈敏度，應用Parl Ehrich 學說（PEI）HBsAg標準品，對ad標準品的靈敏度為0.05ng/ml對ay標準品靈敏度為0.025ng/ml
ELISA檢測試劑盒應用定性夾心免疫檢測技術，用合成的HEV多肽抗原包被微孔板板條，這些多肽是中國型HEV毒株核心氨基酸序列中抗原性很強的肽段，分別來自于該毒株的開放閱讀框2和開放閱讀框3。將樣品或標準品加入孔中并孵育，如果其中存在HEV IgM抗體，這些抗體就會與HEV 的多肽抗原結合，并固定在上面，洗板除去其它非特異性抗體和樣品中的其它成份。然后加入羊抗人IgM-HRP（辣根過氧化物酶）酶結合物，經第二次孵育后，酶結合物就會與*次孵育結合上的HEV IgM抗體相結合，洗板除去未結合的酶結合物，加入TMB底物溶液，在第三次孵育時會發生酶-底物反應，只有那些含有HEV IgM抗體和酶結合物所形成的復合物的孔才會發生顏色變化，加入硫酸溶液終止酶和底物間的反應，并在波長: 450nm處測量O.D.值,按照本HEV IgM抗體elisa試劑盒的測試標準, O.D.值大于或等于Cut-Off值的樣品被認為是初試陽性。

用途
ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結果，使測定方法達到很高的敏感度。 ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。
然而，影響ELISA試驗結果的因素有很多，所以加強各個環節的質量保證才能充分發揮其方法學的優點。

ELISA試劑盒的特點
一、、靈敏、特異的抗體；
　　二、穩定的重復性和可靠性；
　　三、吸附性好，空白值低，孔底透明度高的固相載體；
　　四、適用血清、血漿、組織勻漿液、細胞培養上清液、尿液等等多種標本類型；
　　五、節省實驗經費。

ELISA試劑盒回收率是反應待測物在樣品分析過程中的損失的程度，損失越少，回收率越高，如果作標液1PPM，就是1毫克/升，而作出標準數據為0.99毫克/升，就是說你的回收率是99%，這個與真實成分有密切的關系，說明方法的準確度。比如水中總無機氯含量測定，樣品水中含有無機氯20mg/L，取100mL被測水樣品，加入0.1mL濃度為10mg/mL的含無機氯標準樣品，測定時忽略體積變化，如果測定出樣品中無機氯為2.98mg/L，則認為回收率為99%。

組成結構
1、 血清：操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血紅細胞迅速小心地分離。
2、 血漿：EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。
3、 細胞上清液：1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4、 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘，取上清液。
5、 保存：如果樣品不立即使用，應將其分成小部分-70℃保存，避免反復冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
　　試劑盒成分
　　1 預包被板: 抗小鼠白介素-6兔子IgG,親合純化 96T
　　2 酶標記抗體: (30倍濃縮)HRP標記抗小鼠白介素-6兔子IgG,親合純化 0.4mL x 1
　　3 標準品: 重組小鼠白介素-6 0.5mL x 2
　　4 EIA緩沖液: 含1% BSA, 0.05%吐溫20 BPS 30mL x 1
　　5 標記抗體稀釋液: 含1% BSA, 0.05%吐溫20 BPS 12mL x 1
　　6 顯色劑: TMB底物液 15mL x 1
　　7 終止液: 1N硫酸 12mL x 1
　　8 濃縮洗滌液: (40倍濃縮) 含1% BSA, 0.05%吐溫20 BPS 50mL x 1 操作說明 1實驗所需器材(但試劑盒沒有提供) 酶標儀(450nm) 微移液管及其吸嘴 量筒及燒杯 去離子水 冰箱(4°C) 坐標紙(log/log) 吸水紙 試管(用于標準品稀釋) 溫育箱(37°C ± 1°C) 洗瓶 (用于洗板) 一次性試劑管(用于濃縮酶標記抗體和顯色劑)

雙抗體夾心法
1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為1～10μg/ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃ 放置一晚。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。（簡稱洗滌，下同）。
2.　加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應孔中，置37℃ 孵育1小時。然后洗滌。（同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔）。
3.　加酶標抗體：于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體（經滴定后的稀釋度）0.1ml。37℃ 孵育0.5～1小時，洗滌。
4.　加底物液顯色：于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分鐘。
5.　終止反應：于各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。
6.　結果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀上，于450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對照孔調零后測各孔OD值，若大于規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。

間接法
1.用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃放置一晚；
2.次日洗滌3次；
3.加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml于上述已包被之反應孔中,置37℃孵育1小時,洗滌；
4.（同時做空白、陰性及陽性孔對照）于反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標第二抗體（抗抗體）0.1ml；
5.37℃孵育35-60分鐘，洗滌；
6.’zui后一遍用DDW洗滌。
其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。

試驗原理
試劑盒是固相夾心法酶聯免疫吸附實驗（ELISA）.已知濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內進行檢測。先將生物素標記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標記過的HRP。再經過溫育和洗滌，去除未結合的酶結合物，然后加入底物A、B，和酶結合物同時作用。產生顏色。顏色的深淺和樣品中的濃度呈比例關系。

安全性
1． 避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。
2． 實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。
3． 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。
4． 試劑應按標簽說明書儲存，使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄，不可保存。
5． 實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質。
6． 不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。
7． 使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。
8． 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
9． 洗滌酶標板時應充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水。
10． 底物A應揮發，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應立即讀取OD值。
11． 加入試劑的順序應一致，以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。
12． 按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。

實驗條件的選擇
在ELISA中，進行各項實驗條件的選擇是很重要的，其中包括:
（1）　固相載體的選擇：許多物質可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進行篩選：用等量抗原包被，在同一實驗條件下進行反應，觀察其顯色反應是否均一性，據此判明其吸附性能是否良好。
（2） 包被抗體（或抗原）的選擇：將抗體（或抗原）吸附在固相載體表面時，要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃ 18～24小時。蛋白質包被的zui適濃度需進行滴定：即用不同的蛋白質濃度（0.1、1.0和10μg/ml等）進行包被后，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標本的OD值。選擇OD值zui大而蛋白量zui少的濃度。對于多數蛋白質來說通常為1～10μg/ml。
（3）　酶標記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定（見酶標記抗體部份）。然后再固定其它條件或采取“方陣法”（包被物、待檢樣品的參考品及酶標記抗體分別為不同的稀釋度）在正式實驗系統里準確地滴定其工作濃度。
（4）　酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應，而本身無色。有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌作用，應注意防護。有條件者應使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時間后，應加入強酸或強堿以終止反應。通常底物作用時間，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制，尤其是H2O2在臨用前加入。
進口分裝：
檢測范圍和靈敏度不同，用量少時，可使用分裝，前期是它的長久性不是很好。
試劑盒的標準曲線zui高點OD 值均在2.0±0.2，零孔的OD 值都控制在0.10以下。
試劑盒的標準曲線相關系數R≥0.98。
試劑盒重復性好，板內、板間變異系數均<9 %。
試劑的組份都多給20%的富余量，確保完成48/96孔的檢測，避免分次檢測可能造成試劑量不足的情況。
檢測抗體及酶結合物的稀釋度合適(均為1:30), 方便試驗操作者準確地做稀釋工作，保證實驗結果的重復性。
白介素6是一種細胞因子,已被證實為B細胞分化因子.它是一種抗體形成系統,它的生理特性,如肝細胞急性蛋白合成的誘導和基于和白介素3協同作用的生長等,也備受關注. 并且已證實白介素-6與病理學存在穩定的相關關系.例如,報道多種疾病的生長因子為白介素-6, 骨髓瘤細胞能合成白介素-6并表達白介素-6受體.此外, 白介素6在多種炎性疾病和自身免疫疾病發揮重要的作用. 此試劑盒能高靈敏度的檢測小鼠血清和細胞基質上清的白介素6 原理 此試劑盒運用了兩種特異性抗體,洗板后加入TMB底物液顯色,顯色的強度與小鼠的白介素-6的量成正比. 檢測范圍 10.94的 700 pg/mL 預期用途

ELISA的樣本收集與前期準備

        利用ELISA進行臨床檢驗常見的樣本一般包括血液（指血，靜脈血），尿，糞便，腦脊液，胸腹水，前列腺液，精液，陰道分泌物等，這些樣本收集的時間、方法和保存都有一定的要求。
(一) 臨床樣本的收集
A、血液樣本
    有些生理因素，如吸煙、進食、運動、情緒波動、妊娠、體位等均可影響血液中某些成分的變化，有些甚至還有晝夜變化。因此血液標本的采集應盡量避免生理因素干擾，以條件一致為宜，如無法避免，應在標本上注明該因素。
1．外周血
    一般選取左手無名指內側采血，該部位應無凍瘡，炎癥，水腫，破損。如該部位不符合要求，以其他手指部位代替。對燒傷病人，可選擇皮膚完整處采血。由于部分血液常規檢測（如白細胞計數、分類等）受生理因素影響波動過大，比較時宜使條件盡量一致。涉及到體內出、凝血功能的檢測項目（如血小板計數，出血時間或凝血時間等）的檢測，一定要注意了解患者是否用過抗凝、促凝藥物，以便在減少或避免干擾因素的影響。
2．靜脈血
    除涉及各種止血和血栓檢測等項目需采用抗凝靜脈血血漿外，目前絕大多數檢測項目的分析檢測可直接采用靜脈血的血清。在血清檢測項目中，有些（如血糖，血脂等）受飲食及晝夜因素影響較大，一般以清晨空腹血標本為宜；有些在血中衰變較快（血清酶活性測定如ACP活性等），0~4℃貯存活性減弱也不一，這些項目的檢測必須及時而快速；有些（如肌酸激酶等）受運動等因素影響較大。抽血時避免溶血的發生也十分重要，尤其涉及血鉀，LDH等的測定。

B、尿液樣本
    同血標本一樣，尿液標本受飲食、運動、藥物量等因素的影響也較大，特別是飲食的影響，故一般來說晨尿優于隨機尿。晨尿是指清晨起床后的*次尿標本，較濃縮和酸化，有形成分（如血細胞，上皮細胞，管形）相對集中便于觀察。隨機尿即隨意一次尿，留取方便，但受飲食、運動、藥物影響較甚，易于出現假陽性和假陰性結果，如飲食性蛋白尿，飲食性糖尿，維生素C干擾潛血結果等。餐后尿（午餐后2小時收集的患者尿液）適用于尿糖，尿蛋白和尿膽原的檢查，此時的尿標本可增加試驗敏感性，檢出較輕微的病變。12小時尿細胞計數即Addis計數（前晚8時排空膀胱后留取至次日晨8時的所有尿液），因時間較長，細菌易繁殖，須加入防腐劑甲醛。24小時尿（*天晨8時排空膀胱后留取至次日晨8時的所有尿液）中化學物質的定量，包括蛋白，糖，尿17-酮、17-羥類固醇，兒茶酚胺，Ca2+等，檢測不同的物質，選擇不同的防腐劑防腐。清潔中段尿多用于尿細菌培養，要求無菌，沖洗外陰后留取標本。所有尿標本的收集都應足量，zui少12 ml，50 ml，定時尿須全部收集，對女性患者應避免陰道分泌物、經血污染尿標本。

C、糞便樣本
    糞便標本的檢測對判斷消化系統疾病有重要參考價值。采集時要求用干凈的竹簽選取含有粘液、膿血等異常病變成分的糞便，對外觀無異常的糞便須從表面、深處及糞端多處取材。找寄生蟲蟲體及作蟲卵計數應收集24小時糞便。查痢疾阿米巴滋養體應于排便后立即檢查，從有膿血和稀軟處取材，保溫送檢。查日本血吸蟲蟲卵時應取粘液、膿血部分，孵化毛蚴時至少留取30g糞便，且需盡快處理。檢查蟯蟲卵須用透明薄膜拭子于晚12時或清晨排便前自肛門周圍皺襞處拭取并立即鏡檢。隱血試驗（化學法），試驗前3日禁食肉類及含動物血食物并禁服鐵劑，維生素C等。所有糞便標本采集后1小時內應檢查完畢，以防止有形成分受消化酶及pH的破壞。以上針對臨床樣本指標檢測。

D、腦脊液樣本
    腦脊液標本采集后立即送檢，放置過久將影響檢驗結果：如細胞變性，破壞，導致計數和分類不準；有些化學物質如葡萄糖等將分解含量減少；細菌發生自溶影響細菌的檢出率。腦脊液抽取后一般分裝三個無菌管，*管作細菌培養，第二管作化學分析和免疫學檢查，第三管作一般性狀及顯微鏡檢查，三管的順序不宜顛倒。因標本采集較難，全部送檢和檢測過程應注意安全。

E、胸腹水樣本
    與腦脊液標本一樣，采集后的標本注意安全，及時送檢。一般也分裝三管，一管作常規細胞學檢查，一管生化檢查，一管細菌培養，順序以與腦脊液相同為宜。

F、前列腺液樣本
    前列腺液標本由前列腺按摩后采集，液量少時直接滴在載玻片上及時送檢，須注意防止標本蒸干，量多時收集在潔凈干燥的試管中。若按摩不出前列腺液，可檢查按摩后的尿液沉渣。

G、精液樣本
    精液標本采集前應禁欲3~7天，排凈尿液后可用手淫法或其他方法將精液直接排入干凈的容器中，保溫并及時送檢。由于精子生成日間變動較大，一般應檢查2~3次（每次間隔1~2周）方可做診斷。

H、陰道分泌物樣本
    陰道標本采集前24小時應禁止房事、盆浴、陰道檢查、陰道灌洗及局部上藥等，取材所用器械需清潔。一般用鹽水浸濕的棉拭子自陰道深部或陰道穹后部、宮頸管口等處取材，制成生理鹽水涂片后觀察陰道分泌物標本，經期的女性患者不宜檢查陰道分泌物標本。
 
 
 
(二) ELISA的樣本實驗準備
在收集樣本前都必須有一個完整的計劃，必須清楚要檢測的成份是否足夠穩定。對收集后當天就進行
檢測的樣本，及時儲存在4℃備用。對于隔天再檢測的樣本，及時分裝后凍存在-20℃備用，有條件的，-70℃凍存備用。標本應避免反復凍融。
    液體類標本:  包括血清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液、細胞培養上清等。
1. 血清：
室溫血液自然凝固10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。
2. 血漿：
應根據標本的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。
3. 尿液：
用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照此實行。
4. 細胞培養上清：
檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。
5. 培養細胞
    檢測細胞內的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融或加入組織蛋白萃取試劑，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。
6. 組織標本
    切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），或組織蛋白萃取試劑, 用手工或勻漿器將標本勻漿化。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。

植物組織：首先要稱取樣本的鮮重，樣本重量不能低于50mg。
2，勻漿液一般選取PBS（PH=7.2-7.4)濃度為0.01mol/L。
3，勻漿的比例為10%，即1g組織加9ml的勻漿液
1，保持樣本為鮮重。
2，樣本重量不能低于50mg
3，樣本溶解按照10%的比例，即1g組織加9ml的勻漿液進行溶解
4，勻漿液選取PBS

2010-05-06 22:08 來源：互聯網 點擊次數：6810

HE染色石蠟切片制作的基本過程

1、取材與固定

從人或動物新鮮尸體上取下組織塊(一般厚度不超過0．5厘米)投入預先配好的固定液中(10％福爾馬林，Bouin氏固定液等)使組織、細胞的蛋白質變性凝固，以防止細胞死后的自溶或細菌的分解，從而保持細胞本來的形態結構。

2、脫水透明

一般用由低濃度到高濃度酒精作脫水劑，逐漸脫去組織塊中的水份。再將組織塊置于既溶于酒精，又溶于石蠟的透明劑二甲苯中透明，以二甲苯替換出組織塊的中酒精，才能浸蠟包埋。

3、浸蠟包埋

將已透明的組織塊置于已溶化的石蠟中，放入溶蠟箱保溫。待石蠟*浸入組織塊后進行包埋：先制備好容器(如折疊一小紙盒)，倒入已溶化的石蠟，迅速夾取已浸透石蠟的組織塊放入其中。冷卻凝固成塊即成。包埋好的組織塊變硬，才能在切片機上切成很薄的切片。

4、切片與貼片

將包埋好的蠟塊固定于切片機上，切成薄片，一般為5—8微米厚。切下的薄片往往皺折，要放到加熱的水中燙平，再貼到載玻片上，放45℃恒溫箱中烘干。

5、脫蠟染色

常用HE染色，以增加組織細胞結構各部分的色彩差異，利于觀察。蘇木精(Hematoxylin，H)是一種堿性染料，可將細胞核和細胞內核糖體染成藍紫色，被堿性染料染色的結構具有嗜堿性。伊紅(Eosin，E)是一種酸性染料，能將細胞質染成紅色或淡紅色，被酸性染料染色的結構具有嗜酸性。染色前，須用二甲苯脫去切片中的石蠟，再經由高濃度到低濃度酒精，zui后入蒸餾水，就可染色。

HE染色過程是：

①將已入蒸餾水后的切片放入蘇木精水溶液中染色數分鐘。
　　②酸水及氨水中分色，各數秒鐘。
　　③流水沖洗1小時后入蒸餾水片刻。
　　④入70％和90％酒精中脫水各10分鐘。
　　⑤入酒精伊紅染色液染色2～3分鐘。

6、脫水透明

染色后的切片經純酒精脫水，再經二甲苯使切片透明。

7、封固

將已透明的切片滴上加拿大樹膠，蓋上蓋玻片封固。待樹膠略干后，貼上標箋，切片標本就可使用。