產品編號： EIA06229
使用前*閱讀說明書。本酶聯免疫試劑盒是基于經典酶聯夾心技術原理，能測量大鼠TRF，只能用于研究用途，不得用于醫學診斷。

工作原理
TRF，轉鐵蛋白（transferrin）。轉鐵蛋白是血漿中主要的含鐵蛋白質，負責運載由消化管吸收的鐵和由紅細胞降解釋放的鐵。以TRF-Fe3+的復合物形式進入骨髓中，供成熟紅細胞的生成。TRF分子量約7.7萬，為單鏈糖蛋白，含糖量約6%。TRF可逆地結合多價離子，包括鐵、銅、鋅、鈷等。每一分子TRF可結合兩個三價鐵原子。TRF主要由肝細胞合成，半壽期為7天。血漿中TRF的濃度受鐵供應的調節，在缺鐵狀態時，血漿TRF濃度上升，經鐵有效治療后恢復到正常水平。所提供的ELISA Kit是典型的夾心法酶聯免疫吸附測定試劑盒（ELISA）。預先包被的抗體為多克隆抗體。檢測相抗體也為多克隆抗體，經生物素（biotin）標記。樣品和生物素標記抗體先后加入酶標板孔反應后，PBS或TBS洗滌。隨后加入過氧化物酶標記的親和素反應；經過PBS或TBS的*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的待測因子呈正相關。

每套試劑盒中內容（96T）

材料 數量
標準品 重組凍干品×2
預包被抗體的96孔板 1板（8×12）
生物素標記抗體 0.12ml（1:100）
ABC（親和素-過氧化物酶復合物） 0.12ml（1:100）
樣品稀釋液 15ml×2
抗體稀釋液 12ml×1
ABC稀釋液 12ml×1
TMB顯色液 10ml×1
TMB終止液 10ml×1
ELISA洗滌液 15ml×1（1:25）

需要而未提供的試劑和器材
1． 37℃恒溫箱。
2． 標準規格酶標儀。
3． 自動洗板機。
4． 單通道或多通道可調節移液器以及其吸頭。
5． 蒸餾水，容量瓶等
6． 干凈的試管和Eppendof管。

注意事項
1． 開啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘。
2． 配制各種試劑時，切記混勻！
3． 用戶在初次使用試劑盒時，應將各種試劑管離心數分鐘，以便試劑集中到管底。
4． 建議所有標準品、樣本都做雙份檢測。
5． 要嚴格避免操作過程中酶標板干燥。干燥會使酶標板上生物成份迅速失活！
6． 為免交叉污染，要避免重復使用手中的吸頭和試管。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的PBS或TBS洗滌緩沖液至少0.35ml注入孔內，浸泡1-2分鐘。根據需要，重復此過程數次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

樣品的準備和保存
樣品如果不立即分析，應分裝后冷凍保存，且避免反復凍融。
血清——用干凈試管收集血液，室溫凝固2小時或4℃過夜，離心1000×g 10分鐘，收集血清。立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。
細胞培養、組織勻漿、體液——離心去除沉淀，立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。

樣品稀釋的一般原則
用戶須查閱文獻了解標本內待測因子的含量，決定適當的稀釋倍數，以使稀釋后樣品中待測因子的濃度處于ELISA試劑盒的*檢測范圍。樣品的稀釋應有詳細記錄。

試劑的準備和保存
A. 標準品的稀釋和使用：在使用前2小時內準備。將凍干品管內加入1ml樣品稀釋液，*溶解后做倍比稀釋。
稀釋后的標準品在2小時內使用。

B．生物素標記抗體工作液：在使用前2小時內準備。
1． 根據每孔需要0.1ml計算總的用量（實際配制時應多配制0.1-0.2ml）。
2． 按10ul生物素標記抗體加抗體稀釋液990ul的比例配制工作液。輕輕混勻。

C．親和素-過氧化物酶復合物（ABC）工作液的準備：在使用前1小時內準備。
1． 根據每孔需要0.1ml計算總的用量（實配時應多配制0.1-0.2ml）。
2． 按10ul親和素-過氧化物酶復合物（ABC）加ABC稀釋液990ul的比例配制工作液。輕輕混勻。

D. TMB顯色工作液的準備：在使用之前30分鐘，按TMB顯色液A 9份加 TMB顯色液B 1份的比例配制TMB顯色工作液。

操作程序
1． 確定本次檢測所需的已包被抗體的酶標板孔數目。
2． 將倍比稀釋的標準品各0.1ml依次加入一排7孔中，1孔只加樣品稀釋液的作為對照。處理后的標本按100ul每孔加入。
3． 酶標板加上蓋，37℃反應90分鐘。
4． 反應后用自動洗板機吸去酶標板內的液體；或甩去酶標板內液體，再對著吸水紙拍幾下。洗滌2次。
5． 將準備好的生物素抗體工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反應60分鐘。
6． 0.01M TBS或0.01M PBS洗滌3次，每次浸泡1分鐘左右。
7． 將準備好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反應30分鐘。
8． 0.01M TBS或0.01M PBS洗滌5次，每次浸泡1-2分鐘左右。
9． 按每孔0.1ml依次加入TMB顯色工作液，37℃避光反應，反應過程中，要經常的觀察，當肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔差別不明顯時，即可加入TMB終止液0.1ml/孔。（顯色反應zui長不要超過30分鐘）。
10． 用酶標儀在450nm測定O.D.值。
11． 根據樣品的吸光值在坐標上找出對應的濃度。用戶也可以使用各種應用軟件來計算。應記住由于樣品稀釋了N倍，其實際濃度應該×N。

操作程序總結：
準備試劑，樣品和標準品

加入準備好的樣品和標準品，37℃反應90分鐘

洗板2次，加入生物素化抗體工作液，37℃反應60分鐘

洗板3次，加入ABC工作液，37℃反應30分鐘

洗板5次，加入TMB顯色液，37℃反應

加入TMB終止液

30分鐘之內讀OD值

計算標本待測因子含量

檢測范圍：800ng/ml→12.5ng/ml。
敏感性： ＜3ng/ml
特異性： 系統和其它因子無交叉反應。
保存： -20℃ [短期內（如兩周）可4℃]
有效期： 12個月（-20℃）。
用途： 用于體外定量分析液體標本（通用型）。

REFERENCES
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11. Submitted （MAR-2007） to UniProtKB.
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