一.背景：
被曝光違規(guī)喂食金剛烷胺、利巴韋林等抗病毒藥品的“速生雞”流入市場(chǎng)，對(duì)多家餐飲企業(yè)都產(chǎn)生非常大的負(fù)面影響。利巴韋林又名病毒唑、三氮唑核苷、尼斯可等，是廣譜強(qiáng)效的抗病毒藥物，目前廣泛應(yīng)用于病毒性疾病的防治。利巴韋林通常會(huì)抑制谷胱甘肽，從而影響紅細(xì)胞的細(xì)胞膜，使氧的紅血球細(xì)胞溶解，從而可能引起貧血，這也可能惡化已經(jīng)存在的心臟疾病，另外經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明利巴韋林還有致畸性、致癌性和生殖毒性等。
鑒于利巴韋林會(huì)在動(dòng)物組織中有殘留，所以政府有關(guān)部門(mén)開(kāi)始禁止使用利巴韋林等防治高致病性禽流感等一類(lèi)病原微生物引起的病毒性疫病。我國(guó)對(duì)于動(dòng)物源性食品中利巴韋林殘留含量的相關(guān)研究報(bào)道屬于空白，也未曾制定或立項(xiàng)過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，上也無(wú)特定*及相應(yīng)檢測(cè)方法。而且經(jīng)多方面驗(yàn)證目前還沒(méi)有準(zhǔn)確合適的檢測(cè)方法。
利巴韋林是弱堿性的極性小分子，易溶于水，所以本實(shí)驗(yàn)采用水和乙腈的混合溶液提取雞肉中的利巴韋林。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，離子交換類(lèi)填料對(duì)其吸附不穩(wěn)定，所以本實(shí)驗(yàn)采用MAS-QuChERS方法進(jìn)行凈化處理，利用MAS填料直接吸附雞肉提取液中的雜質(zhì)，利用LC-MS/MS檢測(cè)技術(shù)建立了動(dòng)物源性食品中的利巴韋林的快速檢測(cè)方法。

化合物名稱(chēng)	英文名	結(jié)構(gòu)式	CAS編號(hào)
利巴韋林	Ribavirin Granules		36791-04-5

二.實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑
API 4000+質(zhì)譜檢測(cè)器，配液相色譜儀；高速離心機(jī)；渦旋振蕩混合儀；超聲波振蕩器；氮?dú)鉂饪s儀。
利巴韋林MAS凈化管；利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%）。甲醇、乙腈 （色譜純，博納艾杰爾科技）、甲酸（色譜級(jí)）、實(shí)驗(yàn)用水為超純水；一次性無(wú)菌注射器（博納艾杰爾科技）；針式過(guò)濾器（0.22μm，直徑13mm博納艾杰爾科技）。
2.2 溶液的配制
標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)品適量，用超純水溶解并定容配制成1mg/mL。
標(biāo)準(zhǔn)工作液：用超純水稀釋至合適濃度。
2.3 樣品的提取和凈化
酶解前處理方法：準(zhǔn)確稱(chēng)取1g（至0.01g）均質(zhì)好的雞肉至 50 mL 離心管中，加入5mL10mmol/L乙酸銨溶液（pH=4.8）和20ul磷酸酯酶，渦旋混合2min，于37℃下酶解2h，取出冷卻至室溫，8000r/min離心5min，取全部上清液加入10ml乙腈，渦旋1min后8000r/min離心5min，取5mL上清液加入MAS凈化管中，渦旋1min后8000r/min離心5min，取全部上清液于50℃氮?dú)獯蹈珊螅?mL水復(fù)溶過(guò)0.22μm濾膜，待測(cè)。
2.4 樣品的檢測(cè)
2.4.1 色譜條件
色譜柱：Venusil MP C18（2.1*150mm，5μm，100Å）；
流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液-甲醇=95:5
流速：200μL/min；
柱溫：30℃；
進(jìn)樣量：5μL；
2.4.2 質(zhì)譜條件
電離模式：電噴霧電離正模式；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；離子源溫度（TEM）：550℃，Curtian Gas: 10，Ion Source Gas 1: 70，Ion Source Gas 2:75
表1 質(zhì)譜參數(shù)

化合物	保留時(shí)間/min	Q1	Q3	Decluster Potential	Collision Energy
利巴韋林	3.36	245.4	113.0	53	39
			96.2	53	13

下劃線(xiàn)表示定量離子
2.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.5.1 方法線(xiàn)性關(guān)系和定量限
分別添加利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)溶液至均質(zhì)好的雞肉中，使其形成濃度分別為5ug/kg、10ug/kg、20ug/kg、50ug/kg、100ug/kg的基質(zhì)添加樣品，在通過(guò)2.2所述方法提取凈化后檢測(cè)，以檢測(cè)得到的峰面積，以樣品添加濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)擬合其線(xiàn)性方程，按照S/N=10計(jì)算得到該方法的zui低定量限。

物質(zhì)名稱(chēng)	回歸方程	相關(guān)系數(shù)	zui低定量限（S/N=10）
利巴韋林	Y=2285.5x-1991.5	0.9984	5ug/kg

表2 線(xiàn)性和檢出限

圖1 10ug/kg標(biāo)準(zhǔn)品譜圖
2.5.2 方法的穩(wěn)定性
在均質(zhì)好的雞肉中添加利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)品溶液使其形成10ug/kg的基質(zhì)添加樣品，按照上述方法在相同的條件下檢測(cè)，按照測(cè)得的利巴韋林的出峰時(shí)間及峰面積的值計(jì)算該方法的穩(wěn)定性。
表3 方法穩(wěn)定性

編號(hào)	1	2	3	4	5	RSDn=5 ，%
保留時(shí)間（min）	3.43	3.41	3.43	3.41	3.39	0.49
峰面積	23384	21983	22346	23155	24198	1.39

圖2 10ug/kg雞肉加標(biāo)譜圖
2.5.3 準(zhǔn)確度與精密度
以均質(zhì)好的空白凈化后溶液加標(biāo)實(shí)驗(yàn)證明該方法基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物檢測(cè)存在影響，所以在實(shí)際樣品檢測(cè)過(guò)程中，以空白凈化后溶液加標(biāo)為基礎(chǔ)計(jì)算樣品添加的回收率。
分別在均質(zhì)好的雞肉中添加利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)品溶液使其分別稱(chēng)為含有5ug/kg和20ug/kg的基質(zhì)添加樣品，按照上述方法凈化、檢測(cè)后，測(cè)得的該方法的準(zhǔn)確性結(jié)果如下。
表4 基質(zhì)添加實(shí)驗(yàn)結(jié)果與穩(wěn)定性

添加濃度	1	2	3	RSDn=3
5ug/kg	78%	87%	95%	9.6%
20ug/kg	75%	70%	79%	6.0%