酶橋法：

Mason等（1969年）與Sternberger（1969年）同時(shí)報(bào)道了免疫球蛋白-酶橋法（又稱夾心法或三層法）。其原理主要是利用第二抗體為橋梁，把抗原的特異性抗體與抗HRP抗體結(jié)合起來，后者再與HRP結(jié)合。HRP與其抗體形成復(fù)合物后仍保留其酶活性，可加底物顯色，達(dá)到定位抗原的目的。由于在抗HRP血清中除酶抗體外，還含有非酶抗體，后者與酶抗體競爭在第二抗體上的結(jié)合點(diǎn)，所以抗HRP抗體必須效價(jià)高，才能保證此法的高靈敏性。為此要耗費(fèi)較多的純HRP來制備抗HRP血清。

PAP法與雙PAP法：

為了改進(jìn)酶橋法，Sternberger等人（1970年）又建立了可溶性酶-抗酶 抗體復(fù)合物法（簡稱PAP法）。他們制備了可溶性兔PAP來代替酶橋法中的zui后兩個(gè)步驟，即兔抗HRP抗體與自由HRP兩步。此法既可純化酶抗體以提高方法的靈敏性，又可簡化酶橋法繁多的步驟。可溶性兔PAP是大分子的復(fù)合物，含有三個(gè)分子HRP與兩個(gè)抗HRP抗體，外形呈五角形，分子量429 kD，直徑20.5nm。Vacca等（1980年）提出了雙PAP法，既在用PAP處理組織或細(xì)胞后，重復(fù)使用一次羊抗兔IgG和PAP，zui后顯色。這樣可比單純的PAP法提高靈敏性4～5倍。在用單克隆抗體做*抗體定位抗原是，橋抗體需用羊抗鼠IgG取代羊抗兔IgG，兔PAP需用鼠PAP取代。繼Terngnek（1983年）之后，程明（1987年）在*先制備了鼠PAP，后者是用抗HRP的單抗隆抗體與HRP共育而制成，產(chǎn)物為一個(gè)抗體分子結(jié)合兩個(gè)酶分子，分子量比兔PAP小很多

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