作者單位：1（安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，合肥 230036）2(安徽省獸醫(yī)工作站，合肥 230022）3（安徽農(nóng)業(yè)大學生物技術中心，合肥 230036）

【摘要】  本研究建立了基于基質(zhì)固相分散萃取（MSPD）液相色譜紫外檢測法（HPLC/UVD）的同步檢測雞組織中地克珠利和妥曲珠利殘留的快速、和經(jīng)濟的新方法。正交試驗優(yōu)化后的基質(zhì)固相分散萃取的*條件如下，預混有地克珠利和妥曲珠利混合標準溶液的0.5 g雞組織勻漿在研缽中與2 g Cl8填料研勻，靜置2～5 min后裝萃取柱；萃取柱自底層到上層依次裝入玻璃棉、1.5 g 無水Na2SO4、樣品混合物、0.5 g無水Na2SO4; 壓緊后依次用8 mL正己烷、8 mL甲醇水溶液（1∶4, V/V）淋洗， 8 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，50℃旋轉蒸發(fā)，0.5 mL 流動相溶解，過0.22 μm 濾膜后進樣檢測。*色譜條件為C18分析柱（250 mm×4.6 mm i.d.， 5 μm）；流動相：0.05 mol/L H3PO4三乙胺(pH 3.0)乙腈(40+60)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：240 nm，AUFS =0.05；進樣體積：20μL；柱溫：20℃。該檢測方法的定量線性范圍為50～1000 μg/L。在50、500和1000 ng/g的添加水平，地克珠利和妥曲珠利從雞組織中的回收率范圍為71.1%～84.0%，相對標準偏差的范圍為3.8%～12.1%；同時方法的日內(nèi)和日間相對標準偏差范圍為3.70％～ 6.77%。地克珠利的檢出限為8 ng/g（肌肉）和10 ng/g （肝、腎），妥曲珠利的檢出限為 7 ng/g（肌肉）和10 ng/g （肝、腎）; 地克珠利的定量限為12 ng/g（肌肉）和15 ng/g （肝、腎），妥曲珠利的定量限為 10 ng/g（肌肉）和15 ng/g （肝、腎）。

【關鍵詞】  基質(zhì)固相分散萃取，液相色譜紫外檢測法，地克珠利，妥曲珠利，雞組織

基金項目：“十一五國家科技支撐計劃”分課題（2006BAK02A08４）、安徽省“十五”科技重大攻關項目（0400303041）、安徽省青年基金(04041042)

1 、 引  言

    地克珠利(diclazuril, DIC)和妥曲珠利(toltrazuril, TOL)屬均三嗪類抗球蟲藥，被廣泛用于畜禽球蟲病防治[1]。食品添加劑聯(lián)合專家委員會(JECFA)(1996，1998)和歐盟藥品管理局（EMEA）(1996，2004）在對地克珠利和妥曲珠利的毒理學研究數(shù)據(jù)評估后，制定了日允許攝入量和zui高殘留* [2～5]。

    均三嗪類抗球蟲藥在畜禽生產(chǎn)中的廣泛應用，迫切需要建立一種靈敏的均三嗪類藥物殘留分析方法。歐盟藥品管理局在其評估報告中推薦使用氣相色譜電子捕獲檢測(GCμECD)檢測羊、豬和牛的可食性組織中地克珠利的殘留 [2，3]。祁彥等[６]以HPLC法測定了大豆中13種三嗪類農(nóng)藥殘留。由于地克珠利和妥曲珠利在紫外吸收光譜上的差異，目前尚未見同時分析動物組織中地克珠利與妥曲珠利藥物殘留的報道。

    基質(zhì)固相分散萃取(matrix solid phase dispersion，MSPD)由Barker等[7]提出并給予理論解釋的一種樣品處理技術。MSPD將常規(guī)的固相分散技術與反相鍵合填料相結合，組織勻漿、提取和凈化在同一操作中完成，分析環(huán)節(jié)大為減少、操作簡化。本研究以MSPD為基礎，建立了地克珠利和妥曲珠利的多殘留快速分析技術，并對MSPD樣品處理過程和液相色譜分離條件進行了優(yōu)化。

2、實驗部分

　　2.1  儀器與試劑

    HP1100液相色譜儀（美國Agilent公司），配低壓四元泵、脫氣泵、紫外檢測器、自動進樣器和柱溫箱；Symmtry C18色譜柱（250 mm×4.6 mm i.d.， 5 μm，美國 Waters公司）； 12孔固相萃取裝置（美國Supelco公司）；AM- 6組織勻漿機 ( 株式會社日本精機制作所，北京慧宇誠越科技發(fā)展有限公司)；RE52AA旋轉蒸發(fā)儀 (上海亞榮生化有限公司)；D37520冷凍離心機（德國Osterode am Harz 公司）。C18填料（粒徑40 μm，美國Alltech公司）；地克珠利(99.7%)、妥曲珠利(99.8%)（美國Sigma公司)；乙腈、甲醇和四氫呋喃(色譜純，美國Fisher公司)；其它試劑均為分析純；Millipore 18.2 MΩ cm高純水。

2.2  實驗方法

　　2.2.1  填料和標準溶液制備 

　　C18填料預處理： 22 g C18填料，裝入50 mL玻璃注射器，依次用2倍柱體積的正己烷、二氯甲烷和甲醇洗滌，真空干燥，貯于磨口玻璃干燥器內(nèi)備用。混合標準溶液配置：準確稱取地克珠利和妥曲珠利標準品各10.0 mg，置100 mL容量瓶中，用25 mL四氫呋喃溶解后，用60%乙腈水溶液定容，搖勻，2～8℃避光存放；使用時用60%乙腈水溶液稀釋至所需濃度。

　　2.2.2  色譜條件 

　　分析柱：C18(250 mm×4.6 mm i.d. 5 μm, 美國 Waters公司)；流動相：0.05 mol/L H3PO4三乙胺(pH3.0)乙腈(40+60)，流速：1.0 mL/min；檢測波長：240 nm，AUFS =0.05；進樣體積：20 μL；柱溫：20℃。

　　2.2.3  樣品采集 

　　健康AA肉雞，飼喂全價不含抗球蟲藥物日糧。10 d后，采集肝臟、腎臟、肌肉樣品，置于－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/span>

　　2.2.4  洗脫溶劑的選擇 

　　2.0 g C18填料和一定量混合標準溶液在研缽中用研杵沿同一方向輕輕研勻。混合物放置在通風柜內(nèi)0.5 h后， 轉入層析柱中，并用注射器活塞輕輕壓實。用15 mL正己烷分3次淋洗，分別收集淋洗液，過0.22 μm濾膜后進行液相色譜分析。分別用甲醇、二氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯、超純水作為洗脫劑重復上述實驗步驟。每個實驗平行3次。

　　2.2.5  基體固相分散提取條件的選擇 

　　預混有1 mL地克珠利和妥曲珠利混合標準溶液的0.5 g雞組織勻漿與2 g C18填料在研缽中研勻。上述樣品混合物在通風柜中放置 2～5 min后轉入層析柱。層析柱自下而上依次裝入玻璃棉、1.5 g無水Na2SO4、樣品混合物、0.5 g無水Na2SO4，壓緊。分別用16 mL 淋洗液淋洗，8 mL 洗脫液洗脫，收集洗脫液，50℃旋轉蒸發(fā)至干，用0.5 mL流動相溶解殘渣，過0.22 μm濾膜后作為試樣溶液，然后取20 μL注入HPLC進行檢測。 每處理重復3次，同時設空白對照。為考察C18填料與樣品比例、淋洗劑種類與組合、洗脫劑種類與用量對添加回收結果的影響，采用正交實驗設計，按L9（34）設計表（見表1）進行。表1  因素水平表（略）

3 、結果與分析

　　3.1  檢測波長與色譜分離條件的確定

    文獻記載地克珠利均采用280 nm，而妥曲珠利采用240 nm作為紫外檢測波長[8～10]。為獲得較理想的分析條件，采用紫外分光光度計分別對地克珠利和妥曲珠利進行紫外光譜掃描，結果顯示地克珠利除280 nm處有一吸收峰外，在200～250 nm也有紫外吸收，且其在240 nm處的紫外吸收與妥曲珠利的吸收值相近，故本實驗選擇240 nm作為檢測波長。

    實驗比較了乙酸銨∶乙腈、乙酸三乙胺∶乙腈、磷酸鹽緩沖液∶乙腈和H3PO4三乙胺∶乙腈４種流動相體系對地克珠利和妥曲珠利的分離效果。結果表明，在H3PO4三乙胺∶乙腈體系中地克珠利和妥曲珠利在較短的時間內(nèi)分離效果，且柱壓較低。在本實驗選擇的0.05 mol/L H3PO4三乙胺(pH 3.0)乙腈(40+60)為流動相的條件下，地克珠利和妥曲珠利在12 min內(nèi)獲得基線分離。

　　3.2 定量標準曲線

    用60%乙腈水溶液將混合儲備標準液稀釋為 50、100、200、500、1000 ng/mL的系列工作標準液，進行液相色譜分析。每個濃度點重復測定4次，取平均值繪制色譜峰面積濃度標準曲線，得地克珠利和妥曲珠利藥物標準曲線。地克珠利：CDIC=21.11SDIC–32.76， r＝0.9998；妥曲珠利：CTOL=23.56STOL–21.65，r＝0.9995。C為藥物濃度（ng/mL），S為色譜峰面積（mAu s）。

　　3.3 MSPD條件的優(yōu)化

　　3.3.1  洗脫溶劑的選擇 

　　研究了正己烷、甲醇、二氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯和水對地克珠利和妥曲珠利的洗脫能力（見表2）。由表2數(shù)據(jù)可知：正己烷和水對地克珠利和妥曲珠利無洗脫能力，只能洗掉C18柱上結合力很小的一些雜質(zhì)，適于作淋洗液；二氯甲烷與乙酸乙酯可洗脫部分地克珠利和妥曲珠利，但洗脫能力較弱不適于作為洗脫劑；甲醇和乙腈的洗脫能力強，在較少體積即可達到滿意的回收率。表2  不同溶劑的洗脫回收率（略）

　　3.3.2  正交試驗結果 

　　為減少動物組織中復雜基質(zhì)成分對紫外檢測的影響，本實驗采用兩步洗脫法，先用淋洗液對樣品進行清洗凈化，再使用洗脫劑進行洗脫。按L9（34）設計進行了不同的淋洗液的凈化效果和洗脫劑的洗脫能力研究。研究結果列于表3和表4。

    實驗結果表明，填料用量、洗脫劑種類和用量3種因素對回收率影響較大，達到*回收的因素水平分別為： 2、3、3、3（地克珠利）和2、2、3、3（妥曲珠利）。盡管適用二者的淋洗液組成有一定差異，但考慮到使用8 mL 正己烷+8 mL 甲醇水溶液（1∶4, V/V）較8 mL正己烷+8 mL水淋洗生成的色譜圖要干凈一些，且淋洗液組成在各因素中對回收率的影響zui小，所以本實驗采用了2、3、3、3的組合作為優(yōu)化后的樣品前處理方法。混有一定量混合標準液的0.5 g雞組織樣品加到研缽中的 2 g Cl8填料上，研勻，在通風柜中放置2～5 min后，將混合樣品轉入層析柱中。層析柱自下而上依次裝入玻璃棉、1.5 g無水Na2SO4、樣品混合物、0.5 g無水Na2SO4，壓緊。分別用8 mL正己烷、8 mL甲醇水溶液（1∶4, V/V）淋洗，然后用8 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，50℃旋轉蒸發(fā)至干，用0.5 mL流動相溶解殘渣，過0.22 μm濾膜后作為試樣溶液，然后取20 μL 注入HPLC進行檢測。表3  正交試驗結果（略）表4  地克珠利與妥曲珠利回收率的極差（略）

　　3.4  標準加入的回收率

    稱2 g C18填料置玻璃研缽中，將0.5 g 剁碎的雞組織樣品加到研缽中的C１8填料上，添加1 mL混合標準品溶液（25、250和500 μg/L），使組織中的標準品濃度分別相當于50、500和1000 ng/g，研勻，按優(yōu)化后的方法處理。取處理后的樣品液，用HPLC法測定，按外標法以峰面積計算，測定藥物濃度，計算公式為：X=A樣C對V/A對M式中: X為試料中DIC、TOL的殘留量(ng/g)；A樣為試樣溶液中相應珠利的峰面積；A對 為對照溶液中相應珠利的峰面積；C對 為對照溶液中相應珠利的濃度(μg/L)；V為試樣溶液體積(mL)；M為供試試料的質(zhì)量(g)。以測定結果與實際添加藥物濃度的比值計算樣品添加回收率。由表5中結果可以看出地克珠利和妥曲珠利在3種組織樣品中的回收率均大于70%，符合殘留檢測要求。表5  地克珠利、妥曲珠利在雞組織中提取回收率(略)

　　3.5  精密度(相對標準差)

    取含有地克珠利和妥曲珠利高、中、低(50、100和1000 ng/g) 3種濃度的肌肉組織樣品各3份，按優(yōu)化后的方法處理后測定。分別于同日內(nèi)5個不同時間點及3個不同日內(nèi)重復制樣測定，計算日內(nèi)變異和日間變異。由表6可知地克珠利和妥曲珠利的日內(nèi)、日間變異系數(shù)均低于15%，符合殘留分析對精密度的要求。表6  地克珠利和妥曲珠利的測定精密度（略）

　　3.6  檢出限與定量下限

    取空白的肌肉、肝臟、腎臟樣品，10個平行，按上述樣品前處理的方法處理，測得基線噪音值B0，以B0+3SD為檢出限(LOD), B0+10 SD為定量限(LOQ )。地克珠利的檢出限分別為8 ng/g（肌肉）和10 ng/g（肝、腎）；定量限分別為12 ng/g（肌肉）和15 ng/g（肝、腎）。妥曲珠利的檢出限分別為7 ng/g（肌肉）和10 ng/g（肝、腎）；定量下限分別為10 ng/g（肌肉）和15 ng/g（肝、腎）。結果表明，本方法在準確度、精密度上均達到了殘留分析的要求。