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具體的提取步驟如下:
1.樣品加氯仿分層后,移去上層水相（該水相里就是RNA，可照常繼續(xù)進(jìn)行RNA的提取）,加0.3ml乙醇沉淀中間層和有機(jī)相中的DNA，渦旋混合，室溫放置3分鐘，2-8℃不超過(guò)2000×g離心5分鐘。【注：這一步同時(shí)可以除去未*消化的殘?jiān)?/div>
2.小心吸出沉淀后的上清，加1.5ml異丙醇沉淀蛋白質(zhì)。室溫放置10分鐘，2-8℃12000×g離心10分鐘棄上清。
3.加2ml含0.3M鹽酸胍的95%乙醇洗滌蛋白質(zhì)沉淀。室溫放置20分鐘，2-8℃7500×g離心5分鐘，棄上清，重復(fù)兩次。【注：不太清楚為什么這個(gè)時(shí)候用這么強(qiáng)烈的變性劑？防止蛋白降解？】
4.用2ml無(wú)水乙醇同樣方法再洗一次。
5.真空抽干蛋白質(zhì)沉淀5-10分鐘，用1%SDS溶解蛋白質(zhì)，反復(fù)吸打，50℃溫浴使其*溶解，不溶物2-8℃10000×g離心10分鐘除去。分離得到的蛋白質(zhì)樣品可用于Western Blot或-5至-20℃保存?zhèn)溆谩！咀ⅲ簾o(wú)水乙醇很容易揮發(fā)，所以幾分鐘就能抽干；沒(méi)有真空抽干機(jī)也無(wú)所謂，把無(wú)水乙醇倒掉，開(kāi)蓋子靜置幾分鐘就行了。這一步干燥千萬(wàn)不能太干了，否則溶解的時(shí)候很不爽——很難溶解.我是在50度水浴中過(guò)夜，或者每水浴30分鐘就放在超聲清洗機(jī)里清洗10分鐘——雖然不是專(zhuān)門(mén)用來(lái)粉碎細(xì)胞的超聲，但畢竟是超聲波哦，還是蠻有效果的。
注意事項(xiàng)：
1.以上各試劑的用量都是以1mLTrizol為準(zhǔn)，Trizol體積變化，各試劑用量隨之等比例變化。
2.蛋白質(zhì)沉淀可保存在含0.3M鹽酸胍的95%乙醇或無(wú)水乙醇中2-8℃一個(gè)月以上或-5至-20℃一年以上。
3．這一步可省去：用0.1% SDS在2-8℃透析三次，10000×g離心10分鐘取上清即可用于Western Blot。
常見(jiàn)問(wèn)題分析：
得率低：
A.樣品裂解或勻漿處理不*
B．zui后得到的蛋白質(zhì)沉淀未*溶解
蛋白質(zhì)降解：組織取出后沒(méi)有馬上處理或冷凍
電泳時(shí)條帶變形：蛋白質(zhì)沉淀洗滌不充分
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