背景高且均一

1.抗體濃度過高

降低抗體（一抗/二抗）濃度

2.封閉液選擇不當

比較不同封閉液

3.封閉不*

根據不同的體系優化封閉液

提高封閉物濃度

優化封閉時間和（或）溫度，室溫下至少1小時或4℃過夜

在封閉液中添加終濃度0.05%的Tween-20

用含終濃度0.05%的Tween-20的封閉液稀釋抗體

4.抗體與封閉液中其他蛋白發生交叉反應

更換封閉液

avidin-biotin系統避免使用奶粉，奶粉中含有biotin

檢測交叉反應：封閉一張干凈的不含蛋白的膜，抗體孵育后檢測

5.清洗不充分

增加清洗次數及清洗液體積

如果之前未添加Tween-20，可添加Tween-20至終濃度0.05%

6.曝光時間過長

縮短曝光時間

7.膜出問題

確保轉膜前，已根據廠商指導將膜*浸潤

更換新膜

確保膜始終有足夠的液體覆蓋，避免干掉

避免徒手操作，應配戴手套，使用鑷子

每一步孵育都應確保充分

8.緩沖液污染或長菌

重新配制緩沖液

背景高，且以斑點形式存在

1.抗體濃度過高

降低抗體（一抗/二抗）濃度

2.封閉液選擇不當

比較不同封閉液

3.封閉不*

根據不同的體系優化封閉液

提高封閉物濃度

優化封閉時間和（或）溫度，室溫下至少1小時或4℃過夜

在封閉液中添加終濃度0.05%的Tween-20

用含終濃度0.05%的Tween-20的封閉液稀釋抗體

4.抗體與封閉液中其他蛋白發生交叉反應

更換封閉液

avidin-biotin系統避免使用奶粉，奶粉中含有biotin

檢測交叉反應：封閉一張干凈的不含蛋白的膜，抗體孵育后檢測

5.膜出問題

確保轉膜前，已根據廠商建議將膜*浸潤

避免徒手操作，應配戴手套，使用鑷子

更換新膜

確保膜始終有足夠的液體覆蓋，避免干掉

每一步孵育都應確保充分

膜過多時，應避免相互堆疊

操作時應小心，對膜造成的損傷會產生非特異性反應

6.緩沖液污染

使用新的緩沖液

用前過濾

7.儀器污染

確保轉膜儀、雜交儀等儀器清潔無污染

確保轉膜后膜上沒有殘留的膠

信號弱或無信號

1.轉膜效率低

轉膜結束后，染膠以確定轉膜效率

轉膜時膠與膜應充分接觸

確保轉膜時濾紙與膜裝配正確

按廠商指導將膜充分浸潤

轉膜體系在轉膜過程中避免過熱

使用陽性對照和（或）分子量marker

優化轉膜時間和電流

確保在抗體雜交前的樣品制備條件沒有破壞樣品的抗原性（注意：某些蛋白不能在變性條件下電泳）

2.蛋白與膜結合不充分

在轉膜緩沖液中添加20%的甲醇

低分子量的蛋白使用孔徑較小的膜

3.抗體量不足

增加抗體濃度

抗體可能已經失效，通過點雜交確定抗體活性

4.抗體濃度過高

抗體濃度過高會導致信號迅速減弱，造成信號弱的假象

5.抗原量不足

增加上樣量

6.抗原被封閉液掩蓋

更換封閉液

優化封閉液濃度

7.緩沖液中含有*

*是辣根過氧化酶的抑制劑

8.曝光時間過短

延長曝光時間

9.底物反應時間過短

延長反應時間至5分鐘

10.底物失活

檢查底物活性

確保兩瓶底物之間沒有交叉污染

11.剝膜造成影響

剝膜造成有些抗原丟失或變性，優化剝膜過程

僅在必需時剝膜重雜

避免反復剝同一張膜

12.膜上抗原降解

某些封閉物具有蛋白水解活性（如gelatin）

13.轉好的膜存放時間過長

重新電泳轉膜

非特異性條帶

1. 抗體濃度過高

降低抗體濃度

2.SDS造成非特異性結合

轉膜結束后清洗膜

免疫反應過程中避免使用SDS

3. 二抗試劑的非特異結合

    更換二抗

4.一抗特異性差

采用單抗或親和純化的抗體

彌散條帶

1.抗體濃度過高

降低抗體濃度

2.上樣量過高

減少上樣量

條帶曝空或淬滅迅速

抗體濃度過高

降低抗體濃度，尤其是二抗濃度

僅局部區域有信號

轉膜不*

確保在膠和膜之間沒有氣泡

根據廠商指導將膜*浸潤

避免徒手操作，應配戴手套，使用鑷子

更換新膜

膜過多時，應避免相互堆疊