新突破
新guan肺炎自2019年暴發(fā)以來，給全社會帶來了災難性的影響，不僅對quan世界人民的健康造成了巨大威脅，還對全球經濟產生了震蕩性的影響。因此，對新guan肺炎的研究也顯得愈發(fā)重要。近期，來自北京大學醫(yī)學部精準醫(yī)療多組學研究中心的黃超蘭團隊、中國科學院院士高福團隊以及中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所高峰團隊，通過采用基于質譜的糖基化修飾鑒定技術，對新guan肺炎顆粒上S蛋白的O-糖基化修飾圖譜進行了整體描繪，進而提出了“O-Follow-N”的O糖基化修飾規(guī)律，為新guan肺炎的致病機制探索提供了研究基礎。而這項出色的研究，也于2021年8月2日以“O-glycosylation pattern of the SARS-CoV-2 spike protein reveals an“O-Follow-N” rule”為題發(fā)表在了Cell Research期刊上。
糖基化修飾（Glycosylation）是蛋白質主要的翻譯后修飾類型，其廣泛參與細胞黏附、識別、信號轉導等重要過程，影響蛋白質的分泌、運輸和穩(wěn)態(tài)調控，可發(fā)生在細胞50-70%的蛋白質上，2021年糖基化修飾鑒定被Nature Methods評為zui值得關注的技術之一。
根據糖苷鏈類型，蛋白質糖基化修飾可以分為四類：（1）N-連接糖基化；（2）O-連接糖基化；（3）C-連接糖基化；（4）糖基磷脂酰肌醇錨定。
其中O-糖基化修飾，是在高爾基體中產生。它在人體中有70余種常見糖型，無特定氨基酸結構域。目前，對O-糖基化修飾研究存在許多困難，比如：
1、糖基化修飾的糖鏈形成無固定模版；
2、受200多種糖基轉移酶的復雜調控；
3、糖基化肽段劑量水平低；
4、規(guī)模化糖鏈結構解析通量低；
5、糖鏈構成微不均一性，定性與定量困難；
6、功能性糖基化位點及關鍵糖結構指認困難。
受這些因素影響，對O-糖基化修飾的研究也是少之又少。現階段，對于大規(guī)模、高通量的蛋白質翻譯后修飾的研究，zuihao的途徑就是利用基于高分辨質譜的蛋白質組學技術。在這篇報道中，黃教授等團隊，就是通過基于質譜的蛋白質組學技術，克服一系列困難，shou次對新guan病毒上S蛋白的O-糖基化進行了綜合性描繪。
實驗中，研究者為獲得天然狀態(tài)下S蛋白的N-和O-糖基化修飾完整圖譜，首先從SARS-CoV-2病毒顆粒上獲得S蛋白，并使用了LysC+Trypsin, Chymotrypsin, GluC, Elastase 以及 alpha-Lytic等多種蛋白酶將S蛋白酶解成肽段。而對于這種復雜糖蛋白酶解后產生的肽段，普通質譜很難進行檢測。研究者則采用了具有超高分辨率的Orbitrap Eclipse 三合一質譜儀，并利用三合一儀器多種碎裂功能中的階梯HCD（stepped collisional energy SCE），HCD（Higher-energy collisional dissociation）以及組合式的HCDpdEThcD三種碎裂方法進行質譜分析。
圖1. Orbitrap Eclipse 三合一質譜儀
Orbitrap Eclipse三合一質譜儀是一臺不僅擁有著CID, HCD, ETD HD, EThcD HD, ETciD, UVPD, PTCR等多種碎裂模式的質譜儀，而且還具有高達50萬的分辨率，能夠對多種形式的修飾肽段進行精準定性與定量，為研究者提供了更堅實的硬件基礎。
研究中，研究者共鑒定到了39個糖基化修飾位點。其中包括此前已報道的22個N-糖基化修飾位點，以及17個O-糖基化修飾位點。值得注意的是，這17個O-糖基化修飾位點是shou次從SARS-CoV-2病毒顆粒中提取的S蛋白上鑒定到的。并且通過深入分析這些位點，研究者發(fā)現在這17個位點中，有11個位點位于糖基化的天冬酰胺（Asn, N）附近。為了更準確的對這一現象進行挖掘，研究者將NxS/T共有基序內糖基化的N每一側的3個氨基酸定義為“N±1-3”。分析結果顯示，11個O-糖基化修飾位點分布在“N±1-3”的位置上，位點信息確定的位點有10個，其中7個位點分布在“N+2”的位置上。研究者還通過開展定點突變實驗進一步證實N糖基化修飾的存在是“N±1-3”的位置上出現O-糖基化修飾的先決條件。基于以上分析，研究者提出SARS-CoV-2病毒S蛋白的糖基化修飾存在O-糖基化修飾追隨N-糖基化修飾發(fā)生的現象，并將這一現象命名為“O-Follow-N”規(guī)律。
圖2.新guan病毒S蛋白上符合“O-Follow-N”規(guī)律的O糖基化修飾
小結Summary
研究基于前沿的質譜分析技術，通過使用超高分辨的三合一質譜儀Orbitrap Eclipse，揭示了新guan病毒上S蛋白的O糖基化修飾譜，進而提出了O 糖基化修飾的“O-Follow-N”規(guī)律，同時這一規(guī)律也可能適用于其它蛋白。這個規(guī)律提示O-糖基化修飾具有潛在的調控新機制，特別是N-和O-糖基化修飾之間可能存在的協同作用，未來有望在極大程度上推動糖生物學領域的研究。
黃超蘭
（北京大學醫(yī)學部精準醫(yī)療多組學研究中心主任）
問：根據您的經驗，O-糖基化修飾鑒定的難點在哪里？
答：對于所有的蛋白翻譯后修飾鑒定都普遍存在著幾個相同的難點：（1）修飾豐度相對較低，難以直接鑒定，往往需要進行修飾富集，因此對樣本量等要求較高；（2）修飾調節(jié)為動態(tài)變化過程，鑒定重復性會相對低一點。而對于O-糖基化修飾，因其特殊性，又有幾個其他因素影響：（1）糖基化修飾的糖鏈形成無固定模版，且受多種糖基轉移酶的復雜調控；（2）規(guī)模化糖鏈結構解析通量低，定性與定量困難；（3）功能性糖基化位點及關鍵糖結構指認困難。
問：Orbitrap Eclipse Tribrid三合一質譜聯用儀在該研究中發(fā)揮了怎樣的作用？
答：在我們的實驗體系中，使用了多種蛋白酶對S蛋白進行處理，因此會產生長短不一，形式各異的肽段，而這就要求配套的質譜儀器能夠具有多種碎裂模式，而 Orbitrap Eclipse質譜儀就很好地滿足了我們的需求。并且Orbitrap Eclipse具有很好的分辨率以及穩(wěn)定性，這對我們的實驗提供了很大幫助。
問：新guan病毒顆粒上提取的S蛋白O-糖基化修飾圖譜的揭示對新xing冠狀病毒肺炎的研究有哪些幫助？
答：我們在實驗中發(fā)現了“O-Follow-N”變化規(guī)律，這對研究糖基化的變化具有很好的提示作用。并且這個規(guī)律也顯示O-糖基化修飾具有潛在的調控新機制，特別是N-和O-糖基化修飾之間可能存在的協同作用，未來有望在極大程度上推動糖生物學領域的研究。
專家介紹
黃超蘭教授長期致力于質譜和蛋白質組學前沿新技術和方法的研究開發(fā)，應用范圍包括生物學基礎、醫(yī)學和臨床研究，是高度跨界，善于交叉學科整合，戰(zhàn)略規(guī)劃制定和人員管理的quan方位技能科學家。
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