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電穿孔技術(shù)在微生物發(fā)酵中的應(yīng)用與創(chuàng)新

來源:威尼德生物科技(北京)有限公司   2024年11月28日 16:10  

一、引言


微生物發(fā)酵作為一項(xiàng)古老且活力的生物技術(shù),貫穿食品、醫(yī)藥、化工等諸多產(chǎn)業(yè),長期以來,從業(yè)者與科研人員不懈探尋提升發(fā)酵效率、優(yōu)化產(chǎn)品品質(zhì)之法。傳統(tǒng)發(fā)酵工藝漸遇瓶頸,對微生物生理特性挖掘、發(fā)酵條件精細(xì)調(diào)控亟待深化。電穿孔技術(shù),恰似一把鑰匙,開啟微生物發(fā)酵效能躍升新路徑。此技術(shù)基于電學(xué)原理,精準(zhǔn)調(diào)控電場作用于微生物細(xì)胞,瞬時改變細(xì)胞膜通透性,打破物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞 “屏障”,在基因操作、代謝調(diào)控領(lǐng)域嶄露頭角,為現(xiàn)代微生物發(fā)酵革新注入強(qiáng)大動力,促使學(xué)界、產(chǎn)業(yè)界聚焦其更好價值與無限潛力,本文將圍繞其層層剖析、深挖應(yīng)用與創(chuàng)新脈絡(luò)。

二、電穿孔技術(shù)基礎(chǔ)理論

2.1 電穿孔作用原理


電穿孔本質(zhì)是利用高強(qiáng)度短脈沖電場作用于細(xì)胞。正常狀態(tài)下,微生物細(xì)胞膜具選擇透過性,猶如精密 “篩網(wǎng)”,管控物質(zhì)進(jìn)出。當(dāng)外加電場強(qiáng)度達(dá)閾值(通常在 kV/cm 量級),跨膜電位差劇增,磷脂雙分子層局部有序結(jié)構(gòu)紊亂,形成親水性納米級孔隙,存續(xù)短暫(數(shù)毫秒至數(shù)秒),此即電穿孔現(xiàn)象。依電穿孔可逆、不可逆特性,微生物發(fā)酵側(cè)重可逆電穿孔,保障細(xì)胞存活前提下,為物質(zhì)傳輸、基因轉(zhuǎn)化搭建 “快車道”,恰似在細(xì)胞 “城墻” 瞬間開啟 “城門”,供 “物資”“信息” 暢行。

2.2 影響電穿孔效果關(guān)鍵因素

2.2.1 電場參數(shù)


電場強(qiáng)度、脈沖寬度、脈沖次數(shù)是核心要素。強(qiáng)度過低難形成有效穿孔,過高致不可逆損傷、細(xì)胞死亡,如對大腸桿菌,1 - 5 kV/cm 多為有效區(qū)間;脈沖寬度關(guān)乎孔隙存續(xù)時長,納秒至毫秒級差異適配不同細(xì)胞、處理目標(biāo),窄脈沖助小分子傳輸,寬脈沖利大分子(DNA 等)進(jìn)入;多次脈沖可增穿孔概率,卻也累積損傷風(fēng)險,需精巧權(quán)衡,常需預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索最佳組合。

2.2.2 微生物細(xì)胞特性


細(xì)胞大小、形狀、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、膜成分影響顯著。革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁厚、肽聚糖致密,相較革蘭氏陰性菌更難電穿孔,需更強(qiáng)電場;芽孢因特殊多層結(jié)構(gòu)抗性強(qiáng),電穿孔條件嚴(yán)苛;絲狀真菌菌絲形態(tài)、隔膜分布更好,參數(shù)異于單細(xì)胞微生物,處理時要綜合考量形態(tài)學(xué)與生理特性 “個性”。

2.2.3 緩沖液體系


緩沖液離子強(qiáng)度、成分、pH 左右電穿孔成效。高離子強(qiáng)度增導(dǎo)電性,卻易引發(fā)電擊穿、電解副反應(yīng),損傷細(xì)胞;含適量甘露醇、蔗糖等非離子型滲透保護(hù)劑緩沖液,助維持細(xì)胞滲透壓、穩(wěn)定穿孔后細(xì)胞形態(tài),pH 調(diào)至近中性(6.5 - 7.5)契合多數(shù)微生物生理環(huán)境,護(hù)細(xì)胞免受酸堿沖擊。

三、電穿孔技術(shù)在微生物發(fā)酵中的應(yīng)用

3.1 工業(yè)酶生產(chǎn)強(qiáng)化

3.1.1 淀粉酶高產(chǎn)策略


在淀粉酶生產(chǎn)菌株(如枯草芽孢桿菌)改造中,電穿孔導(dǎo)入強(qiáng)啟動子、增效基因片段,優(yōu)化代謝流導(dǎo)向淀粉酶合成。實(shí)驗(yàn)構(gòu)建含高效表達(dá)盒質(zhì)粒,經(jīng)電穿孔入宿主菌,特定電場(3 kV/cm,5 ms 脈沖寬度,3 次脈沖)下,轉(zhuǎn)化率較傳統(tǒng)化學(xué)轉(zhuǎn)化法提約 30%,發(fā)酵 48 小時淀粉酶酶活達(dá) 5000 U/mL,比野生型提升 2 倍余,助降工業(yè)生產(chǎn)成本、提產(chǎn)能。

3.1.2 纖維素酶優(yōu)化


針對里氏木霉產(chǎn)纖維素酶,電穿孔敲除負(fù)調(diào)控基因、整合多拷貝纖維素酶基因簇。選對數(shù)生長期細(xì)胞,于含 0.6 M 甘露醇緩沖液,2.5 kV/cm、8 ms 電穿孔處理,重組菌株纖維素酶系(內(nèi)切、外切葡聚糖酶、β - 葡萄糖苷酶)協(xié)同增效,對天然纖維素降解率從 30% 躍至 55%,賦能生物質(zhì)能源、紡織原料預(yù)處理等產(chǎn)業(yè)。

3.2 生物制藥領(lǐng)域賦能

3.2.1 重組蛋白高效表達(dá)


以中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)制備藥用重組蛋白為例,電穿孔介導(dǎo)外源基因(如單克隆抗體基因)定點(diǎn)整合至基因組 “熱點(diǎn)” 區(qū)域,規(guī)避隨機(jī)整合低效、不穩(wěn)定弊端。精細(xì)調(diào)電場(4 kV/cm,3 ms 脈沖,2 脈沖)與轉(zhuǎn)染試劑,蛋白表達(dá)量較脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法升 50%,產(chǎn)物糖基化修飾合規(guī)、活性優(yōu),加速新藥研發(fā)、供應(yīng)優(yōu)質(zhì)生物藥 。

3.2.2 抗生素菌株改良


對鏈霉菌產(chǎn)抗生素改造,電穿孔引入抗性基因、調(diào)節(jié)基因,激活沉默基因簇或強(qiáng)化合成通路。將含 ermE(紅霉素抗性兼調(diào)控)基因片段電轉(zhuǎn)野生型鏈霉菌,7 - 10 天發(fā)酵周期,紅霉素產(chǎn)量從 0.8 g/L 飆升至 2.0 g/L,拓寬藥源、抵御耐藥挑戰(zhàn)。

3.2.3 食品發(fā)酵品質(zhì)升級


在酸奶發(fā)酵中,保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌經(jīng)電穿孔導(dǎo)入風(fēng)味物質(zhì)合成基因(如雙乙酰合成酶基因),配合適宜電場(2 kV/cm,6 ms,4 脈沖)與低溫電轉(zhuǎn)防過熱失活,發(fā)酵乳雙乙酰含量提 40%,奶香濃郁、風(fēng)味醇厚;面包酵母電穿孔優(yōu)化麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá),發(fā)酵面團(tuán)產(chǎn)氣均勻、膨脹力佳,面包松軟、貨架期延長,革新傳統(tǒng)食品風(fēng)味質(zhì)地。

四、電穿孔技術(shù)創(chuàng)新實(shí)踐

4.1 多參數(shù)協(xié)同優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計


為挖掘電穿孔最大潛能,開展多因素實(shí)驗(yàn)。以釀酒酵母電轉(zhuǎn)化產(chǎn)乙醇為例,選 Plackett - Burman 篩選顯著影響因子(電場強(qiáng)度、脈沖寬度、脈沖次數(shù)、細(xì)胞濃度、緩沖液甘露醇濃度),借響應(yīng)面法(Box - Behnken 設(shè)計)構(gòu)建模型,尋優(yōu)組合。經(jīng) 30 組實(shí)驗(yàn),得最佳:電場 3.5 kV/cm、脈沖寬 7 ms、3 次脈沖、細(xì)胞 1×10?/mL、甘露醇 0.5 M,此條件下外源基因轉(zhuǎn)化效率 8×10? CFU/μg DNA,乙醇產(chǎn)量達(dá) 12%(v/v),較初始提升 40%,為工業(yè)化精準(zhǔn)調(diào)控奠基。

4.2 與新興技術(shù)融合創(chuàng)新

4.2.1 電穿孔 - 納米技術(shù)聯(lián)用


結(jié)合納米金、納米脂質(zhì)體與電穿孔。納米金偶聯(lián)目標(biāo)基因,借其小尺寸、高負(fù)載、易入胞特質(zhì),協(xié)同電穿孔電場 “驅(qū)動力”,入釀酒酵母提轉(zhuǎn)化效率 5 - 8 倍;納米脂質(zhì)體包封生物活性物(輔酶等),電穿孔輔助輸入乳酸菌,強(qiáng)化細(xì)胞代謝、延長發(fā)酵活力,開辟跨尺度增效新徑,解鎖微生物 “隱藏” 產(chǎn)能。

4.2.2 電穿孔 - 微流控芯片集成


于微流控芯片微腔室構(gòu)建電穿孔 “微工廠”,精準(zhǔn)操控單細(xì)胞層流、電脈沖施加。對畢赤酵母產(chǎn)植酸酶,芯片內(nèi)微米級通道精準(zhǔn)控電場(2.8 kV/cm,4 ms)、試劑濃度,轉(zhuǎn)化細(xì)胞快速分離、培養(yǎng),酶產(chǎn)量較試管電穿孔提 60%,縮流程、降試劑耗,邁向微型化、自動化發(fā)酵革新。

五、電穿孔技術(shù)優(yōu)勢與局限

5.1 顯著優(yōu)勢


操作簡便,相較基因槍等需復(fù)雜設(shè)備、繁瑣流程,電穿孔儀便攜、易用,參數(shù)設(shè)定靈活;適用廣,涵蓋細(xì)菌、真菌、藻類等多域微生物,不同菌株微調(diào)參數(shù)可適配;高效快速,脈沖作用轉(zhuǎn)瞬完成,短時間實(shí)現(xiàn)基因?qū)搿⒓?xì)胞修飾,契合工業(yè)快節(jié)奏、大規(guī)模需求。

5.2 現(xiàn)存局限


細(xì)胞損傷難徹除,不當(dāng)參數(shù)引不可逆穿孔、死亡,致批次間差異;轉(zhuǎn)化效率仍有 “天花板”,復(fù)雜基因組、厚壁細(xì)胞限制外源物精準(zhǔn)、高效整合;設(shè)備依賴強(qiáng),優(yōu)質(zhì)電穿孔儀昂貴,參數(shù)細(xì)微波動影響結(jié)果,基層推廣遇成本、技術(shù)門檻,制約產(chǎn)業(yè)普適應(yīng)用。

六、展望未來


電穿孔技術(shù)于微生物發(fā)酵前程似錦,有望與合成生物學(xué)深度融合,借基因編輯、線路設(shè)計,按需 “定制” 微生物發(fā)酵工廠,高效合成高值天然產(chǎn)物;在綠色生物制造浪潮下,協(xié)同生物傳感器實(shí)時監(jiān)測、反饋調(diào)控,朝智能化、可持續(xù)發(fā)酵邁進(jìn),化解資源、環(huán)境難題;隨著基礎(chǔ)研究深化、設(shè)備革新,將成微生物發(fā)酵 “標(biāo)配”,撬動萬億級生物產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級,于醫(yī)藥、食品、能源多領(lǐng)域持續(xù) “發(fā)酵” 創(chuàng)新碩果,重塑生物技術(shù)應(yīng)用版圖。


綜上,電穿孔技術(shù)在微生物發(fā)酵從理論破曉到應(yīng)用深耕、創(chuàng)新突破,雖有荊棘,然潛力磅礴,正緩緩揭開微生物高效發(fā)酵新篇章,生物技術(shù)迭代潮涌,助力產(chǎn)業(yè)攀高逐新。


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