文章原創(chuàng) 阿YiYi 文章來源：科研綜述

基因治療是一種用于治療或預(yù)防疾病的醫(yī)學(xué)技術(shù)，通過將健康的基因?qū)牖颊唧w內(nèi)來替代或修復(fù)有缺陷的基因。這種方法旨在糾正導(dǎo)致疾病的基因突變或功能異常，從而恢復(fù)或改善患者的正常生理功能。

基因治療的主要原理是通過引入、修復(fù)、或編輯患者體內(nèi)的基因，以糾正或補(bǔ)償導(dǎo)致疾病的遺傳缺陷或基因異常。

圖1. 基因治療原理示意圖 [1]

具體來說，基因治療的核心原理包括：

基因替代

用健康的基因替代缺陷基因，使細(xì)胞能夠產(chǎn)生正常功能的蛋白質(zhì)。例如，將健康的基因?qū)爰?xì)胞中，以替代突變的或缺失的基因。

基因修復(fù)

通過基因編輯技術(shù)直接修復(fù)體內(nèi)的突變基因，恢復(fù)其正常功能。常用的基因編輯工具包括CRISPR-Cas9、ZFNs和TALENs。

基因沉默

使用RNA干擾（RNAi）或反義寡核苷酸（ASO）技術(shù)抑制有害基因的表達(dá)，防止其產(chǎn)生病理性蛋白質(zhì)。

基因補(bǔ)充

為患者提供缺乏的基因產(chǎn)物（如特定酶或蛋白質(zhì)），以補(bǔ)償體內(nèi)的生理缺陷。

圖2. 用于人類基因治療的三種基本工具 [2]。腺相關(guān)病毒（AAV）和慢病毒載體是最近獲得批準(zhǔn)的多種基因療法的基礎(chǔ)。基因編輯技術(shù)目前還處于轉(zhuǎn)化研究和臨床應(yīng)用的初期階段，但預(yù)計(jì)將在該領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的作用。

一、病毒載體

1. 腺病毒載體（Adenoviral Vectors）：腺病毒可以感染多種細(xì)胞類型并高效傳遞基因，能夠攜帶較大的基因片段進(jìn)入宿主細(xì)胞。由于不整合入宿主基因組，降低了插入突變的風(fēng)險(xiǎn)。然而，由于腺病毒載體可能引發(fā)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，因此通常用于短期基因表達(dá)。
   

圖3. 腺病毒的結(jié)構(gòu)和基因組組織 [3]

1. 腺相關(guān)病毒載體（Adeno-Associated Viral Vectors, AAV）：AAV是一種不引起疾病的小型病毒，免疫原性低，能夠攜帶較小的基因片段并將其導(dǎo)入細(xì)胞。AAV載體可長期存在于細(xì)胞中，并在一定程度上穩(wěn)定表達(dá)目標(biāo)基因，因此適用于長期基因表達(dá)和慢性疾病的治療。

圖4. AAV載體轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 [4]。腺相關(guān)病毒（AAV）載體顆粒首先與靶細(xì)胞表面的受體和共受體結(jié)合（步驟1），并通過內(nèi)吞作用進(jìn)入這些細(xì)胞的內(nèi)涵體（步驟2）。從內(nèi)涵體釋放后，AAV顆粒要么被泛素化并針對蛋白酶體介導(dǎo)的降解（步驟3），要么在細(xì)胞內(nèi)被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核（步驟4）。一旦進(jìn)入細(xì)胞核，AAV顆粒的衣殼被去除，AAV基因組被釋放（步驟5）。然后，AAV的單鏈DNA基因組被轉(zhuǎn)化為雙鏈DNA（步驟6），接著是轉(zhuǎn)錄（步驟7）和mRNA的核輸出（步驟8），以便進(jìn)行翻譯和治療性轉(zhuǎn)基因的表達(dá)（步驟9）。通過工程化改造AAV載體影響其轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的任何步驟都會影響其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。 ER：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；ssAAV：單鏈AAV；Ub：泛素。
3. 慢病毒載體（Lentiviral Vectors）：慢病毒載體是一種來源于HIV-1的病毒載體，能夠?qū)⒒蛘系剿拗骷?xì)胞的基因組中，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定且長期的基因表達(dá)。

圖5.第三代慢病毒載體[5]。第三代慢病毒載體由兩個(gè)獨(dú)立的包裝質(zhì)粒組成，一個(gè)編碼gag和pol，另一個(gè)編碼rev。此外，還有一個(gè)質(zhì)粒編碼來自VSV-G（水皰性口炎病毒）的包膜蛋白。編碼目標(biāo)基因的質(zhì)粒包含經(jīng)過改造的慢病毒LTR（長末端重復(fù)）序列，這些序列被改造成自滅活（SIN）型，以防止重組。LTR指長末端重復(fù)，VSV指水皰性口炎病毒。這種載體不僅能夠感染分裂中的細(xì)胞，還可以感染非分裂細(xì)胞，因此在基因治療中具有廣泛的應(yīng)用。慢病毒載體特別適用于治療血液系統(tǒng)疾病和遺傳性疾病，如β-地中海貧血和X-連鎖重癥聯(lián)合免疫缺陷癥（SCID）。

圖6.慢病毒載體的主要臨床用途 [5]。a.原發(fā)性免疫缺陷的矯正。使用病毒載體傳遞共同γ鏈（γc），可以恢復(fù)SCID-X1患者的免疫功能。b. 腫瘤特異性T細(xì)胞受體（TCR）的傳遞。慢病毒載體可用于在體外將識別黑色素瘤抗原的MART-1 TCR引入患者的T細(xì)胞中。經(jīng)過修飾的T細(xì)胞現(xiàn)在能夠識別黑色素瘤細(xì)胞，并作為癌癥治療手段被輸注回患者體內(nèi)。 c. 嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞療法。使用慢病毒載體可以將由三個(gè)不同結(jié)構(gòu)域（抗原識別、共刺激信號傳導(dǎo)、T細(xì)胞信號傳導(dǎo)）構(gòu)成的CAR引入T細(xì)胞中。表達(dá)修飾受體的細(xì)胞能夠識別目標(biāo)抗原，并利用T細(xì)胞強(qiáng)大的細(xì)胞毒活性攻擊腫瘤細(xì)胞。目前，大多數(shù)臨床試驗(yàn)中的CAR T細(xì)胞療法靶向CD19抗原，這是一種在B細(xì)胞和B細(xì)胞惡性腫瘤中表達(dá)的蛋白質(zhì)。 SCID：重癥聯(lián)合免疫缺陷癥。

4. 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（Retroviral Vectors）：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以將基因插入宿主細(xì)胞的基因組中，實(shí)現(xiàn)長期表達(dá)，主要在分裂中的細(xì)胞中起作用。盡管這種載體常用于血液系統(tǒng)疾病的治療，但其可能導(dǎo)致插入突變，從而引發(fā)其他健康問題。

圖7. 逆轉(zhuǎn)錄病毒靶向策略 [6]。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以通過以下方式進(jìn)行改造：插入配體或抗體片段（工程化糖蛋白）、使用來自其他逆轉(zhuǎn)錄病毒的糖蛋白（偽型化），或使用雙特異性抗體（非遺傳靶向）。

二、非病毒載體

1. 質(zhì)粒（Plasmid DNA）：質(zhì)粒DNA通過電穿孔或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染等物理或化學(xué)方法導(dǎo)入細(xì)胞。這些方法在體外實(shí)驗(yàn)中廣泛應(yīng)用，因其較低的免疫原性和無病毒成分的特性，適合初步研究。然而，質(zhì)粒DNA通常不能整合到宿主基因組中，因此基因表達(dá)往往是暫時(shí)的。對于某些長期基因表達(dá)的應(yīng)用，質(zhì)粒的短暫表達(dá)可能是一個(gè)限制因素。

圖8.三重轉(zhuǎn)染策略用于AAV生產(chǎn)[7]。這種方法通過引入關(guān)鍵基因至一個(gè)DNA質(zhì)粒（左上方），以及兩個(gè)其他質(zhì)粒（左下方），消除了對“輔助”腺病毒的需求。這三個(gè)質(zhì)粒被轉(zhuǎn)染到生產(chǎn)細(xì)胞系中（中間），該細(xì)胞系會產(chǎn)生包含目標(biāo)轉(zhuǎn)基因的成熟AAV衣殼。經(jīng)過純化（右側(cè)）后，這些病毒顆粒可以感染患者細(xì)胞并傳遞其DNA載荷，但無法進(jìn)一步復(fù)制。

2. 脂質(zhì)體（Liposomes）：脂質(zhì)體是一種由脂質(zhì)雙層包裹DNA或RNA的非病毒載體。通過與細(xì)胞膜融合，脂質(zhì)體能夠?qū)幕蛭镔|(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞。脂質(zhì)體的優(yōu)勢在于其低免疫原性和生物相容性，但其基因轉(zhuǎn)染效率較低，特別是在體內(nèi)應(yīng)用時(shí)。這種方法通常用于將小核酸（如siRNA）導(dǎo)入細(xì)胞，且更適合短期基因表達(dá)或局部治療。

圖9. 針對基因治療使用的不同類型脂質(zhì)體的研究分布情況[8]

3. 聚合物納米顆粒（Polymer Nanoparticles）：聚合物納米顆粒通過化學(xué)聚合物材料包裹基因物質(zhì)，形成能夠通過細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞的納米顆粒。這種技術(shù)允許對聚合物材料的物理化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行調(diào)整，以優(yōu)化基因轉(zhuǎn)移效率并降低免疫反應(yīng)。盡管聚合物納米顆粒展示了良好的潛力，特別是在定向治療和藥物釋放方面，但其基因傳遞效率在體內(nèi)應(yīng)用中仍需要進(jìn)一步改進(jìn)。

圖10. 用于DNA和siRNA細(xì)胞內(nèi)遞送的聚合物納米顆粒[9]。(1) 陰離子DNA和siRNA與陽離子聚合物復(fù)合形成聚合物復(fù)合體； (2) 通過不同的內(nèi)吞途徑將聚合物復(fù)合體攝入細(xì)胞； (3) 聚合物復(fù)合體在內(nèi)體-溶酶體隔室中包裹并隨后釋放； (4) 聚合物復(fù)合體釋放自由的DNA和siRNA，留下聚合物殘余；(5) DNA通過核膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核進(jìn)行表達(dá)，siRNA與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC）結(jié)合。

三、基因編輯工具

1. CRISPR-Cas9：CRISPR是一種強(qiáng)大的基因編輯工具，可以精確地切割并修復(fù)特定基因，從而糾正基因突變或刪除有害基因。CRISPR技術(shù)應(yīng)用廣泛，已被用于多種疾病的基因治療研究。
   

圖11. 基因組編輯平臺及內(nèi)源DNA雙鏈斷裂（DSB）修復(fù)機(jī)制[10] 。基因組編輯核酸酶（如ZFN、TALENs和CRISPR/Cas9）在靶向位點(diǎn)誘導(dǎo)雙鏈斷裂（DSB）。雙鏈斷裂可以通過非同源末端連接（NHEJ）修復(fù)，或在存在供體模板的情況下通過同源重組（HDR）修復(fù)。通過NHEJ靶向位點(diǎn)進(jìn)行基因破壞會導(dǎo)致插入/缺失突變（indels）的形成。當(dāng)兩個(gè)雙鏈斷裂靶向致病擴(kuò)增或插入的兩側(cè)時(shí)，可以創(chuàng)建對中間序列的治療性缺失，從而實(shí)現(xiàn)NHEJ基因修正。在存在供體修正的HDR模板的情況下，HDR基因修正或基因添加會在期望的位點(diǎn)誘導(dǎo)雙鏈斷裂。縮寫：DSB，雙鏈斷裂；ZFN，鋅指核酸酶；TALEN，轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶；CRISPR/Cas9，簇集規(guī)律間隔短回文重復(fù)相關(guān)9核酸酶；NHEJ，非同源末端連接；HDR，同源重組修復(fù)。

1. TALENs（轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶）：通過識別特定的DNA序列進(jìn)行定點(diǎn)切割，實(shí)現(xiàn)基因編輯。

3. 鋅指核酸酶（ZFNs）：使用鋅指蛋白結(jié)合特定DNA序列進(jìn)行基因編輯。

四、RNA干擾（RNAi）和小RNA（siRNA）

用于基因沉默，通過引入特定的siRNA或shRNA抑制特定基因的表達(dá)，達(dá)到治療效果。

圖12. miRNA（a）和siRNA（b）的工作機(jī)制示意圖 [11]

五、基因剪接技術(shù)

例如 Spliceosome-mediated RNA trans-splicing (SMaRT)，通過改變mRNA剪接，修復(fù)或替換有缺陷的基因序列。

圖13. 三種SMaRT方法的示意圖 [12]。5'轉(zhuǎn)接剪接、3'轉(zhuǎn)接剪接和內(nèi)部剪接修復(fù)（IER），分別靶向突變目標(biāo)前體mRNA的5'端、3'端或內(nèi)部部分。

基因治療的應(yīng)用領(lǐng)域非常廣泛，涵蓋了多種遺傳性疾病、癌癥、罕見病以及某些感染性疾病。

一、遺傳性疾病

基因治療在單基因遺傳病中取得了顯著進(jìn)展，例如：

• 脊髓性肌（SMA）：通過將SMN1基因的功能性副本導(dǎo)入患者體內(nèi)，可以顯著改善患者的運(yùn)動功能和生存率。Zolgensma是針對SMA的基因治療藥物，已被批準(zhǔn)用于臨床。

圖14. 脊髓性肌（SMA）基因治療的簡化示意圖[13]

血友病：通過基因治療將功能性凝血因子基因?qū)牖颊唧w內(nèi)，可以減少或消除患者的出血癥狀。Spark Therapeutics開發(fā)的基因療法已經(jīng)在臨床試驗(yàn)中展示了良好的療效。

圖14.AAV基因治療血友病的歷史回顧 [2]

鐮刀型細(xì)胞貧血癥和地中海貧血：通過將正常的β-珠蛋白基因引入患者的造血干細(xì)胞，能夠糾正血紅蛋白的生成缺陷，減輕或消除疾病癥狀。

圖15：鐮狀細(xì)胞病基因治療的步驟。

二、癌癥

嵌合抗原受體T細(xì)胞療法（CAR-T）：通過基因工程手段改造患者的T細(xì)胞，使其能夠識別并殺死癌細(xì)胞。CAR-T細(xì)胞療法在治療B細(xì)胞白血病和淋巴瘤中表現(xiàn)出顯著的療效，并已獲得FDA批準(zhǔn)。

圖16. 癌癥患者中CAR T細(xì)胞的生成和施用[14]。(A) T細(xì)胞通過血液單采從患者的血液中收集。隨后，它們被基因工程改造以表達(dá)CAR，并在體外進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增。然后將CAR T細(xì)胞輸注回患者體內(nèi)，這些細(xì)胞識別其靶標(biāo)并殺死表達(dá)該靶標(biāo)的腫瘤細(xì)胞。 (B) 四代CAR T細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)的示意圖。

圖17. CAR-T細(xì)胞療法的歷史概述 [2]

腫瘤抑制基因恢復(fù)：基因治療還可以通過恢復(fù)或增強(qiáng)腫瘤抑制基因（如p53）的功能，抑制腫瘤的生長和擴(kuò)散。

三、罕見病

視網(wǎng)膜疾病：基因治療在治療某些遺傳性視網(wǎng)膜疾病（如Leber先天性黑矇癥）方面取得了成功。Luxturna是一種用于治療RPE65基因突變引起的遺傳性視網(wǎng)膜疾病的基因治療藥物，已被批準(zhǔn)用于臨床。

圖18. 基于RPE65基因治療的臨床前里程碑[15]

代謝性疾病：例如肝豆?fàn)詈俗冃裕ㄟ^基因治療將缺陷的ATP7B基因功能恢復(fù)，可以糾正體內(nèi)銅代謝異常，預(yù)防嚴(yán)重的肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)損傷。

四、心血管疾病

家族性高膽固醇血癥（FH）：通過基因治療糾正低密度脂蛋白受體（LDLR）的基因突變，可以降低患者的膽固醇水平，減少心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。

圖19. 針對家族性高膽固醇血癥（FH）患者的新興基因治療方法 [16]。小干擾RNA（siRNA）和反義寡核苷酸（ASO）可以通過基因沉默抑制PCSK9和其他不利于降脂的靶點(diǎn)；CRISPR-Cas9、基因編輯和巨核酸酶可以修復(fù)功能失調(diào)的LDLR或通過基因編輯生成LDLR，從而使不利于降脂的靶點(diǎn)失活；腺病毒、外泌體和基于紙納米抗體的遞送工具可以將上述物質(zhì)遞送至肝細(xì)胞。

五、感染性疾病

HIV：基因治療正在探索通過基因編輯或基因轉(zhuǎn)移手段，抵御HIV感染。例如，通過CCR5基因敲除技術(shù)，賦予T細(xì)胞對HIV的抗性，阻止病毒入侵。

圖20. 傳統(tǒng)的HIV基因治療.(A) 體外基因遞送[17]。使用合適的載體在體外對自體CD4+ T細(xì)胞或CD34+造血干祖細(xì)胞（HSPCs）進(jìn)行基因修飾。修飾后的基因細(xì)胞被輸注回患者體內(nèi)。 (B) 基因修飾HIV靶細(xì)胞的陽性選擇。HIV在易感的HIV靶細(xì)胞（紅色）中復(fù)制。基因修飾的細(xì)胞（綠色）對感染具有抵抗力，并累積到具有治療意義的水平。 (C) HIV復(fù)制周期和基因治療示例。RT，HIV逆轉(zhuǎn)錄酶；IN，HIV整合酶。

六、神經(jīng)系統(tǒng)疾病

帕金森病：基因治療在帕金森病中的應(yīng)用研究包括通過將編碼多巴胺合成酶的基因引入基底神經(jīng)節(jié)，以補(bǔ)充多巴胺缺乏，從而減輕帕金森病的癥狀。

圖21. 基因治療在神經(jīng)退行性疾病中的遞送途徑 [18]。盡管通過靜脈注射或腦脊液（鞘內(nèi)、腦室內(nèi)和腦膜下路徑）給藥可以有效治療多灶性疾病，但實(shí)質(zhì)內(nèi)注射是腦部疾病常用的遞送途徑。對于眼部疾病來說，局部基因遞送更為優(yōu)選，因?yàn)槠涫中g(shù)和器械操作相對簡單。肌內(nèi)注射提供了一種疫苗和抗體遞送及生產(chǎn)的策略，而子宮內(nèi)注射可能為治療遺傳性神經(jīng)退行性疾病提供一種方法。

亨廷頓病：研究人員正在探索通過基因沉默技術(shù)（如RNA干擾）抑制導(dǎo)致亨廷頓病的突變基因表達(dá)，從而延緩或阻止疾病進(jìn)展。

七、免疫缺陷疾病

重癥聯(lián)合免疫缺陷癥（SCID）：通過將正常的IL2RG基因或ADA基因引入患者的造血干細(xì)胞中，基因治療能夠恢復(fù)患者的免疫功能。這一技術(shù)已經(jīng)在多例SCID患者中取得成功，顯著提高了患者的生存率。

圖22. IL2RG基因位點(diǎn)的基因組靶向,基因組整合和修正結(jié)果的示意圖[19]

基因治療的應(yīng)用正在快速擴(kuò)展，并隨著技術(shù)的進(jìn)步和臨床經(jīng)驗(yàn)的積累，越來越多的疾病將能夠通過基因治療得到有效的治療。盡管基因治療仍面臨許多挑戰(zhàn)，如治療的長期效果、安全性、成本和倫理問題，但其在臨床上的成功應(yīng)用已經(jīng)顯現(xiàn)出巨大的潛力。

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