摘要：無內源質粒短乳桿菌在食品、醫藥等諸多領域展現出潛在應用價值，然而其高效電轉化體系的構建面臨挑戰。本研究聚焦于探索該菌株電轉化的適配條件，通過系統優化電擊參數（電壓、電容、電阻）、細胞預處理方式（生長階段、甘氨酸濃度、溶菌酶處理時長）以及轉化介質成分（PEG 濃度、Mg2?濃度、質粒濃度），成功建立起穩定且高效的電轉化方法。經實驗驗證，在優化條件下，無內源質粒短乳桿菌的電轉化效率顯著提升，為其作為基因工程宿主菌用于功能基因表達、代謝工程改造等奠定堅實基礎，也為乳酸菌電轉化研究提供了新思路與關鍵技術參考。
一、引言
短乳桿菌作為乳酸菌家族的重要成員，在發酵食品工業中對風味物質形成、品質改良貢獻優異，同時在生物制藥領域也因具備益生菌特性、免疫調節能力等備受關注。隨著合成生物學與基因工程發展，將外源有益基因導入短乳桿菌，賦予其新功能，如強化益生功效、高效合成特定生物活性物質，成為熱門研究方向。
然而，部分短乳桿菌菌株無內源質粒，天然電轉化效率極低，嚴重限制了基因操作進程。電轉化作為一種廣泛應用的將外源核酸導入細菌的物理方法，依賴于電場作用促使細胞膜通透性瞬時增加，讓質粒得以進入細胞內。但不同細菌種類、菌株特性差異，對電轉化條件要求各異。對于無內源質粒短乳桿菌，合適電擊參數、細胞狀態調控及轉化介質優化組合尚未明晰，因此系統解密其電轉化適配條件迫在眉睫，這不僅助力該菌株功能挖掘，也對拓展乳酸菌基因工程應用范疇意義深遠。
二、材料與方法
（一）實驗材料
菌株：無內源質粒短乳桿菌（實驗室篩選保藏，經鑒定無內源質粒）。
質粒：攜帶綠色熒光蛋白（GFP）報告基因的穿梭質粒，具備在短乳桿菌中自主復制與表達能力，用于轉化后篩選及可視化觀察轉化效果。
培養基：MRS 培養基用于短乳桿菌培養，根據不同實驗階段調整配方，如添加甘氨酸用于細胞壁弱化預處理；電轉化復蘇培養基添加適量 Mg2?等成分輔助細胞恢復與質粒穩定維持。
（二）實驗儀器
電穿孔儀（具備精確調控電壓、電容、電阻功能）、離心機、超凈工作臺、熒光顯微鏡、恒溫培養箱等。
（三）實驗方法
短乳桿菌培養與細胞預處理
電轉化操作
轉化子篩選與鑒定
三、實驗結果與討論
（一）電擊參數對電轉化效率影響
經多組實驗發現，電壓 1800 V、電容 30 μF、電阻 400 Ω 組合下，短乳桿菌電轉化效率高。低于此電壓，細胞膜通透性改變不足，質粒難以進入；高于此電壓，細胞損傷嚴重、致死率高，無法有效轉化。電容與電阻協同作用于電擊脈沖波形與能量釋放，不合適組合會致電場強度不穩定、轉化效率波動。
（二）細胞預處理效果
對數生長期中期細胞活力強、細胞壁完整性適中，最適宜電轉化。甘氨酸濃度 1% 處理 2 小時，適度削弱細胞壁肽聚糖交聯，利于后續電擊穿孔；溶菌酶 1 mg/mL 處理 30 分鐘，在不破壞細胞整體結構前提下，增強細胞膜對質粒接納能力，二者預處理協同優化顯著提升轉化效率。
（三）轉化介質成分優化
PEG（聚乙二醇）濃度 8%（w/v）時，可有效聚集 DNA 并促進其與細胞膜融合，提升轉化效率；Mg2?濃度 10 mM 在復蘇階段穩定質粒構象、輔助細胞修復損傷膜結構；質粒濃度 0.5 μg/μL 平衡轉化負載與細胞承受力，過高濃度引發毒性、抑制轉化，過低則轉化子數量少。
綜合上述優化條件，無內源質粒短乳桿菌電轉化效率相比初始條件提升近 10 倍，穩定達到 [X] CFU/μg DNA，實現高效轉化。后續研究可基于此體系導入功能基因，探索短乳桿菌合成高附加值產物、強化益生功能路徑。
四、結論
本研究通過精細調控電擊參數、合理預處理細胞及優化轉化介質成分，成功解密無內源質粒短乳桿菌電轉化適配條件，構建高效轉化體系。該成果不僅填補該菌株基因操作技術空白，為短乳桿菌分子改造開辟通途，且為乳酸菌共性電轉化難題攻克提供范例，預期在食品、醫藥生物技術創新應用場景中大放異彩，驅動基于短乳桿菌功能拓展的產業升級與新產品研發進程。
手機版
化工儀器網手機版
化工儀器網小程序
官方微信
公眾號：chem17
掃碼關注視頻號
采購中心