在早期的色譜實驗中（Tsvet設計的試驗），疏水性化合物首先從色譜柱中洗脫，然后是極性化合物。這一洗脫順序被稱為正相色譜法（NP）。幾十年后，隨著越來越多的科學家涉足這一領域，其它一些新的分離模式也隨之誕生并用于分離和純化眾多不同基質的各種類別的化合物。雖然我很想一一介紹這些新的方法，但今天我們的重點是反相色譜法（RP）。

對于這種分離模式，離子和強極性分析物會先從色譜柱中洗脫，然后是更具疏水性的分析物。此時，化合物的洗脫順序與 Tsvet的試驗中的相反。因此，這一模式被成為“反相”色譜法。

反相色譜法技術的最終目的是將具備不同疏水性的分析物分離。簡單地說，這項工作可以通過以下兩個步驟完成：

1. 使用一個疏水性固定相來保留分析物。

2. 通過對一個有強弱差異的多組分流動相體系進行優化，使其成為目標分析物的理想洗脫溶劑。這里面可同時包含有機溶劑和緩沖液。并非所有化合物都具有強酸性或強堿性，但它們可能都帶有極性基團，因此需要較窄的pH范圍來控制它們的電離狀態。

烴類是疏水性化合物的較好范例，實際上它們屬于油性物質。具體而言，直鏈烷烴很適合作為固定相使用。我們應當注意的是，隨著化學鏈中的碳原子數量的增加，烴類的物理性質也會發生改變—C1到C4為氣態；C5-C17為液態；C18及以上為固態。除了烷烴外，諸如芳香烴和環烷烴也可作為固定相使用。這些固定相將在其它文章中討論。

C18之所以那么受歡迎，原因之一可能是因為用于鍵合反應的原材料在當時就易于獲得。這一幸運的巧合使人們進一步發現C18原來如此適合用于色譜分析。總之，這兩個因素都讓C18成為了反相色譜法固定相的砥柱。

下一步就是將烷烴基團（即C18或十八烷基）鍵合到合適的基質。硅膠是理想的填料，硅膠顆粒有諸多形態（球形或不定形）、粒徑（0.9 至10 µm或更大）、孔徑（可高達到1000 ?），而且可以有全多孔和實心核兩種形態。

在鍵合過程完成之后（該過程的許多細節都保密），C18配體在分子層級上被連接至硅膠，在硅膠顆粒孔道中的一般分布狀態，如下圖所示。

圖 1. C18配體鍵合在硅膠上

圖 2. 硅膠孔表面上的兩個C18配體分子的一般分布

C18固定相的美妙和簡潔之處在于它能夠帶來非常簡單的疏水作用。流動相中的溶質在硅膠孔道中移動的過程，它們會因為較弱的疏水（以及范德華力）作用而被C18碳鏈吸引和保留。圖3 給出了該相互作用的示例。

圖 3, C18配體和化合物之間簡單的疏水作用

圖4 顯示C18配體與化合物的苯環結構及其丙基部分之間有疏水作用。而由于氮上有正電荷，所以C18配體與分子另一側的氨基之間的吸引力被降到了低值。

用于指示化合物疏水程度的參數被稱為log P。該參數與化合物在正辛醇和水中的分配系數的比值有關。log P值為正則說明目標化合物在正辛醇中的溶解度更高，因此疏水性更強。log P值為負則說明目標化合物在水中的溶解度更高，因此親水性更強。

圖4給出了各類化合物的logP范圍。

圖 4. 各類化合物的log P范圍

在了解這一概念后，如何開展工作就很明確了：要想在 C18色譜柱上保留化合物，那么化合物就必須盡可能為中性或有很高的疏水性。顯然，如果分析物已經是中性或不可能帶有電荷的話，那么我們無法對其進行任何操作。

但是，如果是弱酸性或弱堿性化合物，我們就可以使用緩沖液來控制它們的帶電程度。另一個需要在這里用到的化學概念是pKa（和 pKb）。 溶液中的弱酸和弱堿以兩種形態存在：一種是它們的中性形態，另一種是它們的去質子化形態（酸）或質子化形態（堿）。在特定的pH值下，這兩種共軛形態在溶液中的濃度相同。這時的pH值等于該化合物的 pKa和pKb。

下面的圖中（圖5）給出了這兩個pK值以及化合物的疏水性增減和溶液pH變化之間的函數關系。

圖5. 圖中顯示了弱酸和弱堿共軛物與溶液pH之間的函數關系

在一般實踐中，建議將流動相的 pH值調至在分別高于pKb或低于pKa兩個單位，從而確保化合物所處的形態能使其盡可能在反相模式被保留。當然，任何事情和任何規律都可能有例外的情況。

到目前為止，我們只介紹了流動相的一個組分，也就是水相部分。我們知道需要利用一些化學性質來提高分析物在C18固定相上的保留。現在，我們要討論的自然就是如何從C18固定相洗脫分析物。

為了克服反相條件下的疏水作用，我們常用的是甲醇（MeOH）、乙腈（ACN）和四氫呋喃（THF）這三種溶劑。從強度上來看，MeOH最弱，而THF強。這里說的強度是指使用每種溶劑后分析物洗脫的速度。當流動相比例固定，對于單個分析物來說，使用THF相比使用其它兩種溶劑而言洗脫速度要快得多。

但是，如果有多種分析物，那么溶劑強度高并不代表選擇性也會成比例地提高。在以后的文章中，我們會介紹反相色譜法中溶劑選擇性的差別。