在生命科學的探索之路上,原核蛋白表達重要的技術手段。然而,在這個過程中,科研人員常常面臨諸多難點。比如,蛋白表達量低得讓人沮喪,好不容易進行實驗,卻發現經過漫長的等待后只得到微量的產物;或者蛋白錯誤折疊,形成難以處理的包涵體,使得后續的純化和研究工作舉步維艱;又或者在選擇宿主菌和表達載體時感到迷茫,如同在迷霧中摸索,不知哪一個組合才是選擇。那么,如何破解這些難題呢?關鍵就在于正確選擇原核蛋白表達的宿主菌和表達載體。你選對了嗎?讓我們一同深入探討,尋找開啟成功原核蛋白表達之門的鑰匙。
原核表達常用載體
pET 系列載體:
優點:
高表達水平:是應用非常廣泛的一類原核表達載體,具有高拷貝數,能使目的基因在大腸桿菌中實現高水平表達,適合需要大量蛋白的實驗。
調控精確:利用 T7 啟動子系統,T7 RNA 聚合酶具有很強的轉錄活性,并且可以通過加入誘導劑(如 IPTG)來精確調控基因的表達,可調節基礎表達水平以優化目標基因的表達。
多種選擇:有多種載體–宿主菌組合可供選擇,并且有不同的融合標簽和表達系統配置,還包含可溶性蛋白生產、二硫鍵形成、蛋白外運和多肽生產等專用載體和宿主菌,能滿足不同的實驗需求。
克隆方便:許多載體以 LIC(連接非依賴的克隆)載體試劑盒提供,可用于迅速定向克隆 PCR 產物,操作相對簡便。
缺點:
基礎表達:在某些情況下可能會出現基礎表達水平較高的現象,對于一些對蛋白表達量和時間要求非常嚴格的實驗,需要更精確地控制表達條件。
復雜操作:部分載體的構建和操作相對復雜,需要對載體的特性和實驗操作有較好的理解和掌握。pGEX 系列載體:
優點:
易于純化:利用 tac 啟動子,表達時會表達出包含谷胱甘肽巰基轉移酶(GST)標簽的融合蛋白。GST 標簽可以與谷胱甘肽樹脂特異性結合,便于使用親和層析進行純化,然后再用凝血蛋白酶或者 factor Xa 因子切割融合蛋白去除標簽。
提高溶解性:GST 標簽有助于增加外源蛋白的溶解度,對于一些難溶性蛋白的表達有一定幫助,能夠提高蛋白的穩定性和可操作性。
嚴謹調控:該系列載體上有一個 lacIq 基因,能夠表達更多的阻遏蛋白以實現嚴謹的誘導調控,降低本底表達。
缺點:
標簽影響:GST 標簽相對較大,可能會對目的蛋白的結構和功能產生一定影響,在某些對蛋白純度要求高的實驗中,去除標簽的步驟可能會增加操作復雜性和時間成本2。pBAD 和 pAraB 系列載體2:
優點:
誘導表達:這些載體使用 araB 操縱子,可以用來在缺乏丙氨酸解氨酶的大腸桿菌突變株中,通過 L - 丙氨酸誘導目的基因的表達,誘導條件相對溫和,對細胞的毒性較小。
可調控性:可以根據加入的 L - 丙氨酸的濃度來調節基因的表達水平,實現一定程度的表達調控。
缺點:
表達水平:總體來說,其表達水平可能不如一些強啟動子的表達載體高,對于需要高產量蛋白的實驗可能不太適用。
宿主限制:需要特定的大腸桿菌突變株作為宿主,宿主的選擇范圍相對較窄。pUC 系列載體:
優點:
高拷貝數:含有 pMB1 復制子,具有較高的拷貝數,平均每個細胞可達 500 - 700 個拷貝,有利于獲取大量的質粒。
篩選方便:具有來自大腸桿菌 lac 操縱子的 lacZ’基因,所編碼的 α- 肽鏈可參與 α- 互補作用,在 IPTG 誘導和底物 X-gal 存在下,可形成藍色和白色菌落,便于篩選重組體。
多克隆位點:具有多克隆位點區段(MCS),便于具有不同粘性末端的外源基因的插入,克隆操作相對簡單。
缺點:
表達量較低:主要是克隆載體,表達元件相對較少,表達水平相對其他專門的表達載體可能較低,一般更適合用于克隆和初步的基因操作5。pBV220 系列載體:
優點:
溫度調控:含有 clts857 基因(cl 基因的溫度敏感突變體),該基因表達的 Cl 蛋白能夠抑制啟動子 Pr 和 Pl,又對溫度敏感。所以該系列載體可以用溫度對外源基因的轉錄進行調控,無需添加誘導劑,減少了誘導劑對細胞的潛在影響。
非融合表達:SD 序列后面緊跟著就是多克隆位點,便于帶有起始密碼子 ATG 的外源基因的插入并表達成非融合蛋白,有利于保持目的蛋白的天然結構和功能。
缺點:
熱休克影響:在溫度激活的過程中,大腸桿菌中的熱休克蛋白也會表達,可能會降解表達的外源蛋白,影響目的蛋白的產量和質量。
調控不精確:溫度調控相對不如誘導劑調控精確,且對實驗環境的溫度控制要求較高,需要精確的溫度控制設備來保證實驗的重復性。pT7 系列載體:
優點:
強啟動子:以 T7 啟動子為核心,T7 啟動子具有非常高的轉錄效率,能夠驅動目的基因的高效表達,對于一些需要大量表達目的蛋白的實驗非常有利。
專一性強:T7 RNA 聚合酶只識別 T7 啟動子,具有很高的專一性,能夠避免其他雜蛋白的產生,提高目的蛋白的純度。
缺點:
宿主要求高:需要宿主細胞中含有 T7 RNA 聚合酶或者攜帶能夠表達 T7 RNA 聚合酶的基因,如大腸桿菌 BL21(DE3)等特定的菌株,對宿主細胞的要求較高。
毒性問題:在某些情況下,T7 啟動子的高表達能力可能會對宿主細胞產生一定的毒性,影響細胞的生長和存活,需要優化表達條件來降低毒性影響。
表達載體選擇的考慮因素
目的蛋白的特性:
蛋白大小:如果目的蛋白相對較小,可以選擇一般的高拷貝數載體,如 pUC 系列等;如果蛋白較大,可能需要選擇具有較強啟動子和翻譯效率的載體,以確保蛋白能夠順利表達。對于特別大的蛋白,還需考慮載體的承載能力和對蛋白表達的影響。
蛋白的疏水性:疏水性強的蛋白在表達過程中容易聚集形成包涵體,此時可選擇能促進蛋白可溶性表達的載體,如 pGEX 系列等。GST 標簽可以增加蛋白的溶解性,有助于提高疏水性蛋白的表達水平和可溶性。
是否含有特殊結構:例如含有較多二硫鍵的蛋白,在原核表達系統中正確形成二硫鍵可能存在困難。對于這類蛋白,需要選擇能夠提供合適氧化還原環境的宿主菌以及相應的表達載體,或者采用特殊的表達策略,如在較低溫度下進行誘導表達,以促進二硫鍵的正確形成。如果目的蛋白是膜蛋白,其表達和折疊需要特定的膜環境,選擇的載體和宿主菌應能夠在一定程度上模擬膜環境,或者選擇具有相關輔助蛋白的表達系統。表達水平的需求:
強啟動子與高拷貝數:如果需要獲得高表達水平的蛋白,應選擇具有強啟動子的載體,如 pET 系列載體中的 T7 啟動子,能夠使目的基因在大腸桿菌中實現高水平的表達。同時,高拷貝數的載體也有助于提高蛋白的表達量,但也要注意過高的拷貝數可能會對宿主細胞造成負擔12。
誘導條件的適配性:一些載體的啟動子需要特定的誘導劑和誘導條件才能實現高效表達。例如,pTrc 系列載體的 Trc 啟動子可以通過色氨酸的濃度來調控目的基因的表達;pBAD 和 pAraB 系列載體利用阿拉伯糖操縱子,通過 L - 丙氨酸誘導目的基因的表達。根據實驗的便利性和對表達水平的精確調控需求,選擇合適的誘導系統1。蛋白的純化需求:
純化標簽的選擇:常見的純化標簽有 His-tag(組氨酸標簽)、GST-tag(谷胱甘肽 S - 轉移酶標簽)、Flag-tag 等。His-tag 相對較小,對蛋白的結構和功能影響較小,并且可以通過鎳柱親和層析進行快速純化;GST-tag 較大,能提高蛋白的溶解性,但純化后可能需要去除標簽,且純化過程相對復雜一些。如果后續實驗對蛋白的純度要求較高,需要選擇與純化方法相適配的標簽和載體。
多標簽系統:有些情況下,為了便于蛋白的純化、檢測或其他操作,可以選擇帶有多個標簽的載體。例如,同時帶有 His-tag 和 Flag-tag 的載體,可以利用不同的純化方法進行驗證和純化,提高蛋白的純度和可靠性。宿主菌的特性:
宿主菌的兼容性:不同的原核表達載體適用于不同的宿主菌。例如,pET 系列載體通常與大腸桿菌 BL21 (DE3) 等具有 T7 RNA 聚合酶系統的菌株配合使用,能夠實現高效表達;而一些特殊的宿主菌,如 Rosetta (DE3),對稀有密碼子有較好的適應性,適合表達含有稀有密碼子的外源基因。在選擇載體時,要確保其與所使用的宿主菌相兼容。
宿主菌的生長特性和培養條件:宿主菌的生長速度、培養溫度、營養需求等因素也會影響表達載體的選擇。例如,有些宿主菌在高溫下生長良好,對于需要在較高溫度下表達的蛋白,可以選擇適合該溫度條件的宿主菌和載體;而對于一些對溫度敏感的蛋白,則需要選擇在較低溫度下生長的宿主菌,以避免蛋白的變性和降解。
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